Name: Reconstitución del ensamblaje de actina ramificada mediado por miosina I en un ensayo de motilidad de colas de cometa de actina basado en microesferas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-09-03T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprende a reconstituir el ensamblaje de actina ramificada mediado por miosina I en un ensayo de motilidad de colas de cometa de actina basado en microesferas. Este método permite estudiar la dinámica del citoesqueleto y la generación de fuerza en interfaces tipo membrana.

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Agradecemos al Dr. Daniel Safer y a Rick Wike por su excelente asistencia técnica en la purificación de proteínas. Agradecemos al Dr. Roberto Dominguez, especialmente a la Dra. Malgorzata Boczkowska y al Dr. Grzegorz Rebowski, por proporcionar generosamente el complejo Arp2/3 y las proteínas CapZ. También agradecemos al Dr. Luther Pollard, al Dr. Faviolla A. Báez-Cruz y a todos los miembros de los laboratorios Ostap y Dominguez por sus valiosas contribuciones durante todo el proyecto. Este trabajo fue financiado por una subvención del National Institutes of Health R37 GM057247 (a E.M.O.). E.M.O. y M.X. recibieron apoyo parcial del National Science Foundation (CMMI-1548571). ChatGPT se utilizó para ayudar con la edición del lenguaje durante la revisión del manuscrito. Los autores revisaron y editaron todo el contenido asistido por inteligencia artificial y asumen plena responsabilidad por el manuscrito final.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros competitivos ni conflictos de interés.

El ensayo de motilidad de perlas con cola de actina en forma de cometa es un sistema bien establecido de reconstrucción in vitro para investigar el ensamblaje ramificado de actina mediado por el complejo Arp2/3 y su papel en la generación de fuerzas protrusivas14,15,16,17. Este sistema se ha aplicado ampliamente para analizar la regulación bioquímica del ensamblaje ramificado de actina14,15,26,27,31,49,50,51 y la generación de fuerza20,21,22,23,52, al tiempo que proporciona un marco para estudios cuantitativos de las propiedades emergentes de materia activa de las redes de actina19,35,36,53. Al incorporar miosina, particularmente miosina-I18, en este sistema reconstruido, el ensayo modificado permite investigar cómo el acoplamiento entre miosina y actina modula el ensamblaje de actina y la producción de fuerza en la interfaz de la membrana, un área que aún permanece relativamente poco explorada. Es importante destacar que la miosina-I en este sistema puede reemplazarse fácilmente por otros motores de miosina para examinar sus respectivos roles en la remodelación de la red de actina y en la generación de fuerza. Por ejemplo, podrían incorporarse miosina V (transporte de carga)54, miosina VI (tráfico endocítico y dinámica de membrana)55,56, miosina VII y XV (organización de estereocilios y microvellosidades)57,58,59, miosina X (formación de filopodios)60,61 y miosina XIX (dinámica mitocondrial)62 para investigar cómo diferentes clases de miosina contribuyen a la organización de la actina y a sus procesos fisiológicos asociados.
El ensayo es altamente reproducible siempre que se controlen cuidadosamente varios parámetros críticos. Primero, el G-actina monomérico de alta calidad es esencial para una formación robusta de colas tipo cometa. Recomendamos purificar la G-actina a partir de polvo de acetona de músculo esquelético de conejo utilizando protocolos establecidos41. Después de 2–3 días de diálisis, la actina monomérica debe purificarse adicionalmente mediante filtración en gel sobre Sephacryl S-300 en tampón G (2 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.2 mM ATP; 0.1 mM CaCl2; 1 mM NaN3; y 0.5 mM DTT). Deben utilizarse las fracciones recolectadas inmediatamente después del pico de elución. La G-actina purificada generalmente conserva una fuerte actividad de polimerización durante 2–3 semanas cuando se almacena sobre hielo a 4 °C, y puede seguir siendo utilizable hasta la cuarta semana, aunque su rendimiento generalmente disminuye después. Una menor robustez en las colas tipo cometa, caracterizada por redes de actina escasas y frágiles y un crecimiento de cola inconsistente, suele indicar una calidad deficiente de la actina. Segundo, la actividad de los factores de nucleación (NPF) determina críticamente la formación de colas tipo cometa. El dominio WCA etiquetado con GST de la proteína de síndrome de Wiskott-Aldrich neuronal humana (N-WASP) (GST-VCA) comercial proporciona una actividad de nucleación robusta y sostenida, y la dimerización del GST potencia aún más esta actividad63. Recomendamos validar cualquier construcción de NPF mediante un ensayo de polimerización de actina pirénica antes del recubrimiento de las perlas. La actividad del GST-VCA comercial puede servir como estándar de referencia. Cabe destacar que el GST-VCA comercial utilizado aquí carece de una región poliprolina y, por lo tanto, no interactúa con los complejos de profilina–actina26. Tercero, la visualización confiable del crecimiento de las colas tipo cometa requiere una preparación cuidadosa de las láminas y cubreobjetos. Recomendamos limpiar exhaustivamente las láminas y cubreobjetos con agua y etanol, seguido de limpieza con plasma inmediatamente antes de su uso. Cuando están disponibles, se prefieren los cubreobjetos silanizados con polietilenglicol26, ya que minimizan la adsorción proteica no específica y mejoran la reproducibilidad. Incluir una concentración adecuada de albúmina sérica bovina (BSA) en la mezcla de motilidad puede reducir aún más las interacciones superficiales no específicas y promover un rendimiento constante del ensayo. Cuarto, el volumen de muestra aplicado a la cámara es crítico para obtener mediciones confiables15,16,17. Un volumen excesivo de muestra provoca el desplazamiento de las perlas, impidiendo un seguimiento preciso del alargamiento de la cola tipo cometa. En contraste, un volumen insuficiente de muestra comprime las perlas entre la lámina y el cubreobjetos, aumentando la fricción e inmovilizando las perlas. Esta restricción mecánica puede distorsionar la morfología de la cola tipo cometa y alterar la cinética de crecimiento medida. Por lo tanto, optimizar tanto la altura de la cámara como el volumen de muestra es esencial para obtener resultados reproducibles. Recomendamos optimizar empíricamente el volumen de muestra para cada configuración experimental. Al utilizar un cubreobjetos de 22 mm × 22 mm como se describe aquí, la aplicación de 2,1–2,3 µL de la mezcla de motilidad produce una altura de cámara de aproximadamente 4,3 µm, lo que permite una posición estable de perlas de 2,0 µm de diámetro sin desplazamiento excesivo ni compresión.&#160; Cuando se utiliza un cubreobjetos de tamaño diferente, el volumen de muestra debe ajustarse en consecuencia para lograr un llenado uniforme de la cámara, una posición estable de las perlas y un desplazamiento mínimo de la muestra.
Si no se forman colas de cometa, verifique la competencia de la polimerización de actina y la actividad de los factores de nucleación (NPF). Si no ocurre la ruptura de simetría, ajuste la concentración de CP para modular la densidad de la red. Las redes excesivamente densas resisten la fractura, mientras que las redes demasiado escasas carecen de integridad estructural. Si las perlas recubiertas con miosina no muestran diferencia respecto a las perlas de control, confirme la densidad superficial de miosina y la actividad del motor. Para el control de calidad, el criterio de aceptación es funcional y no se basa en un umbral numérico absoluto. Se considera aceptable una nueva preparación si,&#160;reproduce la formación y crecimiento de colas de cometa observados con una preparación validada previamente (como se muestra en&#160;Figura 3). Además, cada nueva preparación de miosina, complejo Arp2/3, NPF, CapZ o actina debe evaluarse utilizando los ensayos de control de calidad apropiados y compararse con una preparación validada previamente antes de su uso, para garantizar la consistencia en experimentos cuantitativos (véase Sección del Protocolo 3.1).
Se deben considerar varias limitaciones de este ensayo al interpretar los resultados. En primer lugar, la intensidad de fluorescencia se utiliza como un indicador relativo y sin calibrar de la densidad de la red de actina; por lo tanto, las comparaciones deben realizarse únicamente entre muestras obtenidas con configuraciones idénticas de adquisición e analizadas utilizando el mismo protocolo de umbralización. En segundo lugar, la motilidad de las perlas, el crecimiento de las colas tipo cometa y la eficiencia de crecimiento proporcionan lecturas indirectas del comportamiento generador de fuerza de la red, pero no constituyen mediciones directas de la fuerza. Se requieren mediciones mecánicas directas, como el trampa óptica o ensayos de deformación de membrana con calibración de fuerza64,65, para cuantificar las fuerzas producidas por la red. En tercer lugar, este ensayo no resuelve directamente la ultraestructura de la red de actina, por ejemplo, la orientación de los filamentos, la densidad de ramificaciones o la organización local de miosina.&#160;Podrían requerirse enfoques complementarios, como microscopía electrónica o imágenes de superresolución, para la caracterización de la estructura a escala nanométrica&#160;. Por último, el uso de perlas rígidas de tamaño micrométrico proporciona una interfaz simplificada y manejable experimentalmente, pero no captura la deformabilidad, la heterogeneidad de la curvatura, la movilidad lipídica ni la complejidad molecular de las membranas celulares. Por lo tanto, el desarrollo futuro de interfaces más fisiológicamente relevantes será importante para investigar cómo los componentes del citoesqueleto se coordinan en el borde delantero de la célula.
En general, este enfoque de reconstitución permite un control preciso sobre la composición y concentración de proteínas, haciendo posible desentrañar mecanicísticamente componentes individuales de formas difíciles de lograr en sistemas celulares. Proporciona una plataforma versátil para estudiar cómo los motores moleculares remodelan redes de actina ramificadas y moldean la generación de fuerza en interfaces similares a membranas. Con una validación adecuada, el ensayo puede ampliarse para examinar cómo diferentes clases de miosina, variantes motoras mutantes o asociadas a enfermedades, y proteínas que se unen a la actina sensibles a la fuerza regulan la retroalimentación mecánica dentro de redes de actina dinámicas. De manera más general, este sistema ayuda a conectar la actividad del motor a escala molecular con la organización y función mecánica del citoesqueleto a escala mesoscópica, con implicaciones para la motilidad celular, la endocitosis y la remodelación de membranas.

La polimerización de actina ramificada mediada por el complejo de proteína relacionada con la actina 2/3 (Arp2/3) genera las fuerzas protrusivas principales que impulsan diversos procesos celulares, incluyendo la motilidad celular, la endocitosis, la fagocitosis y la formación de complejos de adhesión celular1,2,3,4,5,6. En el borde delantero de las células migratorias, los factores que promueven la nucleación (NPFs) activan el complejo Arp2/3 en la membrana plasmática, iniciando el ensamblaje de una red dendrítica de actina que empuja la membrana hacia adelante. Los motores de miosina-I frecuentemente colocalizan con estas redes de actina ramificada en las interfaces de membrana y se ha implicado su participación en la regulación&#160;de la organización de la actina&#160;y en la modulación de la generación de fuerza7,8,9,10,11,12,13. A pesar de la evidencia acumulada que indica que la miosina-I contribuye a procesos mecánicos dependientes de la actina, los mecanismos moleculares mediante los cuales la miosina-I interactúa con el ensamblaje de actina ramificada mediado por Arp2/3 para modular la arquitectura de la red y el rendimiento mecánico aún no se comprenden bien.
Para abordar esta brecha, incorporamos la miosina-I al sistema bien establecido de movilidad de perlas con cola de cometa de actina14,15,16,17 para reconstruir la interacción entre la miosina-I, la actina y el complejo Arp2/3 en la superficie de perlas del tamaño de micrones. El objetivo general de este método es investigar cuantitativamente cómo el acoplamiento miosina-actina influye en el ensamblaje de actina ramificada, la arquitectura de la red, la ruptura de simetría y la motilidad de las perlas en una interfaz similar a una membrana. En este ensayo, la miosina-I y los factores de nucleación (NPF) se recubren conjuntamente sobre perlas a escala microscópica para imitar su colocalización en la membrana plasmática18. Tras iniciar la polimerización, los NPF unidos a la superficie estimulan el ensamblaje ramificado de actina dependiente de Arp2/3, lo que conduce a la formación de una capa de actina, la ruptura de simetría y el desarrollo de una cola de cometa polarizada&#160;que impulsa la propulsión de las perlas14,19,20,21,22,23. Al variar sistemáticamente la densidad superficial de miosina18 y modular la densidad de la red de actina mediante la concentración de la proteína tapadora (CP)15,19,24, este método permite el análisis cuantitativo de la cinética del ensamblaje de actina, la eficiencia de crecimiento, la arquitectura de la red y la motilidad de las perlas, proporcionando lecturas indirectas relacionadas con los cambios dependientes de la miosina-I en la producción mecánica.
El ensayo también ofrece ventajas distintas frente a enfoques complementarios. En comparación con los ensayos de polimerización masiva, como los ensayos con actina-pireno, este sistema de movilidad de microesferas permite la visualización directa del ensamblaje de actina ramificada y del movimiento de las microesferas impulsado por la polimerización de actina. A diferencia de los estudios celulares, en los que funciones proteicas superpuestas y entornos celulares complejos pueden ocultar contribuciones individuales y complicar la interpretación, este ensayo proporciona un control preciso sobre la composición, concentración y organización superficial de las proteínas, permitiendo así una investigación sistemática de cómo la miosina-I interactúa con el ensamblaje de actina mediado por Arp2/3 en condiciones bioquímicas definidas.
Este método es especialmente adecuado para estudiar cómo los componentes del citoesqueleto se coordinan en una interfaz similar a una membrana&#160;para regular la arquitectura de la red de actina y su producción mecánica. Aunque el protocolo actual está optimizado para el ensamblaje de actina ramificada mediado por miosina-I, su diseño modular podría adaptarse en el futuro para examinar otras clases de miosinas asociadas a membranas (por ejemplo, miosina VI, VII, X, XV y XIX) y/o proteínas que se unen a la actina (por ejemplo, forminas, proteína fosforilada estimulada por vasodilatadores (VASP), cortactina, coronina o tropomiosina). Dichas adaptaciones requerirían la validación de la inmovilización, actividad y densidad superficial de las proteínas. Además, el ensayo es compatible con estrategias de marcado por pulso-cacería. La incorporación de actina fotoconvertible o fotoactivable, o subunidades de Arp2/3 marcadas, podría permitir la medición de las tasas de renovación de los filamentos y de disociación de las ramas dentro de la red en crecimiento25. En conjunto, este ensayo proporciona una plataforma versátil para examinar la interacción molecular entre motores asociados a membranas, filamentos de actina y proteínas que se unen a la actina, así como para investigar cómo los motores y las proteínas que se unen a la actina regulan la remodelación de la red y la generación de fuerza en interfaces similares a membranas14,15,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Más ampliamente, también sirve como una plataforma mínima y ajustable de materia activa para investigar los principios físicos subyacentes a la dinámica fuera del equilibrio impulsada por motores, tales como la ruptura de simetría, la autoorganización, la retroalimentación mecanoquímica y otros comportamientos emergentes en redes activas de actomiosina18,19,20,21,22,23,35,36, con posibles implicaciones en la física de materia activa y la ingeniería de materiales.

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5&amp;prime;-trifosfato de disodio hidratado</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>Utilizado para preparar tampones que contienen ATP; alícuotas y almacenar a &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Complejo Arp2/3</td><td>Preparado in situ</td><td>N/A</td><td>Utilizado para nucleación de redes de actina ramificadas; purificado según la referencia 42.</td></tr><tr><td>Colorante fluorescente Biotina-CF640</td><td>Biotium</td><td>80032</td><td>Utilizado para marcar fluorescentemente las perlas de control; proteger de la luz y almacenar a &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mio1d biotinilada</td><td>Preparado in situ</td><td>N/A</td><td>Proteína motora utilizada para recubrir perlas recubiertas de miosina; preparada según se describe en las referencias 18 y 38&amp;ndash;40.</td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Utilizada para bloquear perlas y en tampones de almacenamiento de perlas; preparar una solución stock filtrada.</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Componente del tampón utilizado en el tampón X y en experimentos de interrupción por calcio.</td></tr><tr><td>Calmodulina</td><td>Preparado in situ</td><td>N/A</td><td>Se añade a las reacciones que contienen miosina y al tampón de almacenamiento de perlas; purificada según la referencia 44.</td></tr><tr><td>Perlas de poliestireno carboxilado (diámetro de 2,0 &amp;micro;m)</td><td>Polysciences</td><td>18327-10</td><td>Utilizadas como soporte sólido para el recubrimiento con factor promotor de nucleación (NPF), NeutrAvidina, colorante fluorescente y miosina; almacenar a 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Teledyne</td><td>01-RET-R6-R-M-14-C-OC</td><td>Utilizada para la adquisición de imágenes de fluorescencia durante la microscopía de lapso de tiempo.</td></tr><tr><td>Tinción con Azul Brillante de Coomassie</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td>Utilizada para teñir geles de SDS-PAGE antes del análisis densitométrico.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos, 22 mm &amp;times; 22 mm, #1.5</td><td>Globe</td><td>1404-15</td><td>Utilizados con portaobjetos para armar cámaras de compresión.</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>Agente reductor utilizado en tampones y mezclas de motilidad; almacenar a &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Bomba de vacío de espiral seca</td><td>Agilent Technologies</td><td>IDP3B01</td><td>Utilizada para operar el sistema de limpieza por plasma.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>GoldBio</td><td>E-217-100</td><td>Agente quelante del calcio utilizado en el tampón M, tampón de motilidad y pretratamiento de actina.</td></tr><tr><td>Fuente de luz externa</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>Fuente de luz de haluro metálico para microscopía de fluorescencia.</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>Código abierto</td><td>N/A</td><td>Utilizado para el análisis de la longitud de colas de cometa, intensidad de fluorescencia y densidad de redes (versión 2.16.0/1.54p).</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Leica</td><td>DMIRB</td><td>Microscopio invertido de epifluorescencia utilizado para obtener imágenes de colas de cometa de actina.</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP2401-212</td><td>Componente de la solución de descoloración de geles de SDS-PAGE; corrosivo, manejar con las precauciones adecuadas.</td></tr><tr><td>GST-VCA</td><td>Cytoskeleton</td><td>VCG03-A</td><td>Factor promotor de nucleación utilizado para la ensambladura de actina mediada por Arp2/3; alícuotas y almacenar a &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GoldBio</td><td>H-400-1</td><td>Reactivo tampón utilizado en el tampón X, tampón M y tampón de motilidad.</td></tr><tr><td>CapZ humano</td><td>Preparado in situ</td><td>N/A</td><td>Proteína de cierre utilizada para regular la densidad de la red de actina; purificada según la referencia 43.</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Spectrum Chemical</td><td>M1035</td><td>Componente del tampón utilizado en tampones de reacción y pretratamiento de actina.</td></tr><tr><td>Software de imagen MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Utilizado para el control del microscopio y la adquisición de imágenes (versión 7.10.4.459).</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>MX0485-3</td><td>Componente de la solución de descoloración de geles de SDS-PAGE; inflamable, manejar según los procedimientos de seguridad institucionales.</td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>Se añade al tampón de motilidad para aumentar la viscosidad de la solución (1500 cP).</td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>Corning</td><td>2947-75X25</td><td>Utilizados para armar cámaras de compresión para microscopía.</td></tr><tr><td>Proteína NeutrAvidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Utilizada para inmovilizar proteínas biotiniladas en la superficie de las perlas; alícuotas y almacenar a &amp;minus;80&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Escalera de proteínas preteñidas PageRuler Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619</td><td>Marcador de peso molecular utilizado para el análisis de SDS-PAGE; almacenar a &amp;minus;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Limpieza por plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>Utilizada para limpiar por plasma portaobjetos y cubreobjetos antes del ensamblaje de la cámara.</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa de poliéter sulfona, 0,22 &amp;micro;m</td><td>Sigma</td><td>SLGPR33RS</td><td>Utilizado para filtrar la solución stock de albúmina de suero bovino antes de la alícuota.</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-1</td><td>Sal utilizada para mantener la fuerza iónica en los tampones del ensayo.</td></tr><tr><td>Actina de músculo esquelético de conejo</td><td>Preparado in situ</td><td>N/A</td><td>Purificada según la referencia 41 y utilizada como G-actina en ensayos de ensamblaje de colas de cometa de actina.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td>Utilizada para la precipitación de perlas durante la preparación y los pasos de lavado de perlas.</td></tr><tr><td>Mezclador rotatorio (rotador de banco)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-04397-40</td><td>Utilizado durante las incubaciones de recubrimiento de perlas para mantener la suspensión de perlas.</td></tr><tr><td>Tampón de corrida Tris/Glicina/SDS (10&amp;times;)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>Diluir a 1&amp;times; antes de la electroforesis en SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Grasa al vacío</td><td>High Vac Depot</td><td>408524</td><td>Utilizada para sellar cámaras de compresión antes de la imagen de fluorescencia.</td></tr><tr><td>Gel de poliacrilamida SDS con gradiente del 4%&amp;ndash;20%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Utilizado para el análisis de SDS-PAGE de proteínas asociadas a perlas; almacenar a 4&amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

reconstitución del ensamblaje de actina ramificada mediado por miosina i en un ensayo de motilidad de colas de cometa de actina basado en microesferas

Reconstituting Myosin-I-Mediated Branched Actin Assembly in a Bead-Based Actin Comet-Tail Motility Assay

La polimerización de actina ramificada mediada por el complejo de proteína relacionada con la actina 2/3 (Arp2/3) proporciona las fuerzas principales de empuje para una variedad de procesos celulares, incluyendo la migración celular, la endocitosis y la fagocitosis. Se ha demostrado que los motores miosina-I, que frecuentemente colocalizan con redes de actina ramificada en el borde delantero de la célula, también participan en estos procesos y se cree que regulan la organización de la red de actina y su producción mecánica. Sin embargo, los mecanismos moleculares mediante los cuales la miosina-I interactúa con el complejo Arp2/3 para modular el ensamblaje de actina ramificada y la generación de fuerza permanecen en gran parte desconocidos. Aquí describimos un ensayo de movilidad de perlas con colas de cometa de actina in vitro altamente ajustable que reconstruye la interacción entre la miosina-I, la actina y el complejo Arp2/3 en el borde delantero de la célula sobre la superficie de perlas del tamaño de micrómetros. Este método se adapta de ensayos bien establecidos de colas de cometa de actina mediante la inmovilización conjunta de miosina-I con factores que promueven la nucleación (NPFs) sobre las superficies de las perlas, creando así una interfaz de ensamblaje de actina similar a una membrana. El ensayo permite la visualización y el análisis cuantitativo del ensamblaje de la red de actina, la densidad de la red, la movilidad de las perlas y la eficiencia de crecimiento. También proporciona lecturas indirectas y cualitativas del aumento de fuerza mediado por la miosina-I en redes de actina ramificada. Este protocolo incluye la funcionalización de perlas, el ensamblaje de la reacción, la imagenología por fluorescencia, el análisis cuantitativo de imágenes y estrategias de solución de problemas, ofreciendo una plataforma reproducible para estudiar el ensamblaje de actina regulado por miosina-I en interfaces similares a membranas.

Se utilizó el ensayo de motilidad de perlas con cola de actina en forma de cometa para investigar el efecto de la actividad de la miosina-I sobre el ensamblaje de actina ramificada mediado por el complejo Arp2/3 en el borde delantero de la célula, recreando escenarios en los que la miosina-I asociada a la membrana coordina con la polimerización de actina para impulsar la protrusión de la membrana7,8,9,10,11,12,13. Para imitar la colocalización de la miosina-I y los factores de nucleación de actina (NPF) en la interfaz membrana-actina, ambas proteínas se recubrieron conjuntamente sobre la superficie de perlas a escala microscópica, reconstituyendo así su proximidad espacial en un sistema in vitro controlado (Figura 1A,B).
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig1.jpg" /> 
Figura 1. Reconstitución del ensamblaje de actina ramificada mediado por miosina-I en microesferas. (A) Esquema que muestra las interacciones entre la miosina-I, los factores de promoción de la nucleación (NPF), el complejo de proteína relacionada con actina 2/3 (Arp2/3), la proteína tapadora (CP) y la actina globular (G-actina) en el borde anterior de la célula. (B) Esquema de la funcionalización de las esferas. Las esferas de control y las recubiertas con miosina fueron recubiertas con NPF y neutravidina. La neutravidina se conjugó con un colorante fluorescente de color rojo lejano biotinilado para las esferas de control o con Drosophila Myo1d biotinilado para las esferas recubiertas con miosina. (C) Serie temporal representativa que muestra el crecimiento de colas cometa de actina desde la ruptura de simetría hasta la formación de colas cometa polarizadas, para una esfera de control y una esfera recubierta con miosina. El último panel muestra ambas esferas en el mismo campo de visión. Barra de escala, 5 µm. Los paneles B y C se reproducen/modifican de Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, con permiso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para evaluar mejor la contribución específica de la miosina-I al ensamblaje de actina, también se construyó una perla de control correspondiente. Las perlas de control eran idénticas a las perlas recubiertas con miosina, excepto que la miosina-I se sustituyó por un colorante fluorescente biotinilado de color rojo lejano conjugado a neutravidina (Figura 1B). Mezclar ambos tipos de perlas dentro de la misma cámara de reacción e imaginarlas en el mismo campo de visión permitió una comparación directa del ensamblaje de actina ramificada en presencia y ausencia de miosina-I bajo condiciones experimentales idénticas (Figura 1C). Además, al variar la relación miosina-a-PFN en la superficie de la perla, se pudo examinar sistemáticamente el efecto de la miosina-I en diferentes densidades superficiales (Figura 2A,B). Asimismo, la densidad de la red de actina pudo ajustarse modificando la concentración de CP, generando redes que iban desde estructuras densamente empaquetadas, resistentes a la ruptura de simetría, hasta arquitecturas débilmente organizadas y propensas a fracturarse15,19,24. Este enfoque permitió investigar cómo la miosina-I influye en el ensamblaje de actina ramificada en redes de densidad y estabilidad estructural variables (Figura 2A,B).
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig2.jpg" /> 
Figura 2. Morfología de cola de cometa de actina&#160;a través de densidades superficiales de miosina y concentraciones de proteína tapadora. (A) Imágenes de fluorescencia representativas de 2-&#181;m- cuentas de diámetro recubiertas con densidades superficiales diferentes de miosina y ensambladas en reacciones que contienen 30–200 nM de proteína tapadora (CP), 4 &#181;M actina con actina marcada con rodamina al 5 % y 200 nM de Arp2/3&#160;complejo. Para cada condición, se obtuvieron imágenes de perlas de control y perlas recubiertas con miosina en el mismo campo de visión. Las densidades superficiales de miosina y del factor de nucleación (FNP) se determinaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, como se describe en el paso 2.3. Las imágenes se adquirieron entre 20 y 35 minutos después del inicio de la reacción. El brillo y el contraste se ajustaron de forma lineal e idéntica dentro de cada par de perlas control–miosina, pero se escalaron independientemente entre condiciones para una mejor visualización. Barra de escala, 5 &#181;m. (BMapa cualitativo del ensayo que resume los resultados de las colas de cometa en función de las concentraciones de CP y las densidades superficiales de miosina. Cada punto de datos representa un par de microesferas control–miosina emparejadas bajo la condición indicada. Los símbolos indican los resultados observados, incluyendo microesferas recubiertas de miosina que promueven la ruptura de simetría, colas más largas, colas similares, colas más cortas, ausencia de formación de colas de cometa o estructuras tipo asteroide. Los datos se recopilaron a partir de más de 20 experimentos independientes, analizando más de 10 pares de microesferas para cada condición. Esta figura se reproduce/modifica de Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, con permiso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Al mezclar los componentes del ensayo, las NPF unidas a la superficie estimularon el ensamblaje de actina ramificada mediado por el complejo Arp2/3 alrededor de la superficie del corpúsculo. En una reacción típica exitosa, la actina apareció primero como una capa dispersa que rodeaba al corpúsculo. A medida que avanzaba la polimerización, la capa se expandía y la red se volvía más densamente enredada. El ensamblaje continuo de actina en la superficie del corpúsculo impulsaba el crecimiento externo de la red, lo que podía provocar la ruptura de simetría y la formación de una cola cometa polarizada. Una vez establecida una cola cometa, la nucleación y polimerización continua de actina en la superficie del corpúsculo sostenía el movimiento prolongado del corpúsculo (Figura 1C). Estas características secuenciales de formación de la capa de actina, ruptura de simetría, extensión de la cola cometa y propulsión del corpúsculo sirvieron como indicadores visuales de que el ensayo funcionaba correctamente.
Como se informó en nuestro estudio original18 y se ilustra en la Figura 2A,B, la morfología de las colas tipo cometa fue sensible tanto a la concentración de CP como a la densidad superficial de miosina. Bajo condiciones estándar del ensayo (200 nM del complejo Arp2/3, 50 nM de CP, relación miosina:PFN = 0,43:1), las perlas recubiertas con miosina producían típicamente colas de actina más escasas o más difusas que las perlas de control (Figura 2A). A bajas concentraciones de CP (&#60;30 nM), la actina se ensamblaba en capas densas y resistentes a fracturas. Bajo estas condiciones, las perlas de control a menudo permanecían encapsuladas y no experimentaban ruptura de simetría, mientras que las perlas recubiertas con miosina tenían mayor probabilidad de romper la simetría y escapar del caparazón circundante de actina (Figura 2A,B). A altas concentraciones de CP (&#62;200 nM), la cohesión de la red se reducía, y la presencia de miosina desestabilizaba aún más la red de actina, promovía la pérdida de actina y evitaba la formación de colas tipo cometa estables (Figura 2A,B). Estos resultados dependientes de las condiciones proporcionan puntos de referencia útiles que los investigadores pueden utilizar para identificar regímenes adecuados de ensayo y solucionar problemas de rendimiento del ensayo.
El efecto de la miosina-I sobre la morfología de las colas cometiformes de actina puede evaluarse midiendo la intensidad media de fluorescencia de la cola cometa. La región de la cola cometa se definió utilizando un umbral de intensidad, como se describió en el paso 4.2, y luego se midió la intensidad media de fluorescencia dentro de esta región (Figura 3A). Bajo condiciones de imagen equivalentes, en las que se adquirieron imágenes de perlas de control y perlas recubiertas con miosina en el mismo campo de visión, este valor sirvió como un indicador relativo y sin calibrar de la densidad de la red de actina, siendo una intensidad media más baja indicativa de una red más dispersa. Bajo condiciones estándar del ensayo, las perlas recubiertas con miosina generaron típicamente colas cometiformes con menor intensidad media de fluorescencia que las perlas de control, lo que es consistente con una densidad aparente de la red reducida (Figura 3C).
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig3.jpg" /> 
Figura 3. Flujo de trabajo para la cuantificación de la cinética de crecimiento y la eficiencia de ensamblaje de las colas de cometa de actina. (A) Series temporales representativas del crecimiento de colas de cometa a partir de una perla control y una perla recubierta con miosina en una proporción de 0,43:1, en presencia de 50 nM de proteína tapadora (CP). Los contornos negros indican las regiones de interés (ROIs) de las colas de cometa identificadas mediante Fiji para mediciones de intensidad de fluorescencia. Condiciones de la reacción: 4 µM de actina con 5% de actina marcada con rodamina, 200 nM del complejo proteína relacionada con actina 2/3 (Arp2/3) y 50 nM de CP. Barra de escala, 5 µm. (B) Longitud de la cola de cometa representada en función del tiempo para el par representativo de perlas control y con miosina mostrado en el panel (A). El recuadro muestra la ventana temporal utilizada para el ajuste lineal, y las tasas de crecimiento de la cola se determinaron a partir de las pendientes de las líneas ajustadas. (C) Intensidad total de fluorescencia de la cola de cometa normalizada representada en función del tiempo para el par representativo de perlas control y con miosina mostrado en el panel (A). Las perlas control y las perlas con miosina se normalizaron respecto a la intensidad media de fluorescencia de las perlas control entre 1100 y 1300 s. El recuadro muestra la ventana temporal utilizada para el ajuste lineal, y las tasas de ensamblaje de fluorescencia se calcularon a partir de las pendientes de las líneas ajustadas. (D) Tabla resumen que muestra la tasa de crecimiento de la cola, la tasa de ensamblaje de fluorescencia y la eficiencia de crecimiento para el par representativo de perlas control y con miosina mostrado en el panel (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El efecto de la miosina-I en la cinética de crecimiento de las colas de cometa puede cuantificarse midiendo tanto la elongación de la cola de cometa como la acumulación de fluorescencia de actina a lo largo del tiempo. En la mayoría de los experimentos, las colas de cometa crecieron a una velocidad aproximadamente constante durante los primeros ~10 min tras la ruptura de simetría. A medida que los componentes de polimerización se agotaban, la elongación disminuía progresivamente y generalmente cesaba aproximadamente 30 min después del inicio de la reacción. Para cuantificar la cinética de crecimiento, se representaron gráficamente la longitud de la cola de cometa y la intensidad total de fluorescencia en función del tiempo (Figura 3B,C). Los primeros 7–10 puntos de datos, correspondientes a la fase lineal inicial, se ajustaron mediante regresión lineal (Figura 3B,C, insertos). Las pendientes de estos ajustes representaron la velocidad inicial de crecimiento de la cola y la velocidad de ensamblaje de la fluorescencia de actina, respectivamente. La eficiencia de crecimiento se definió como la velocidad de crecimiento de la cola de cometa dividida por la velocidad de ensamblaje de la fluorescencia de actina, cuantificando así con qué eficacia la polimerización de actina se convertía en un desplazamiento productivo del corpúsculo (Figura 3D). En el ejemplo representativo mostrado en Figura 3A–D, el corpúsculo recubierto de miosina exhibió una velocidad de crecimiento de la cola de 0,60 µm/min (0,010 µm/s), en comparación con 0,57 µm/min (0,0095 µm/s) para el corpúsculo control (Figura 3B,D). Las eficiencias de crecimiento correspondientes fueron 5,6 y 4,5 µm/unidad de intensidad, respectivamente, lo que representa un valor aproximadamente 1,2 veces mayor para el corpúsculo recubierto de miosina (Figura 3D). Bajo condiciones estándar, los corpúsculos recubiertos de miosina generalmente exhibieron velocidades de crecimiento comparables a las de los corpúsculos control (miosina: 0,69 ± 0,10 µm/min; control: 0,66 ± 0,20 µm/min), junto con una velocidad de ensamblaje de fluorescencia de actina más baja (aproximadamente 0,76 veces la del control) y una eficiencia de crecimiento aproximadamente 1,4 veces mayor, como se informó previamente en nuestro estudio original18. Estos valores se reportan como media ± DE a partir de 11 pares de corpúsculos por condición obtenidos en cinco experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t pareada de dos colas, como se describe en el estudio original18.
Para evaluar la contribución del golpe de potencia de la miosina y descartar la posibilidad de que los efectos observados se debieran a impedimento estérico debido a la ocupación de la superficie por la miosina, el ensayo de motilidad con perlas puede realizarse en condiciones que interrumpan la actividad del golpe de potencia de la miosina-I. En este protocolo, la actividad del motor de la miosina-I se inhibió mediante la adición de 1,1 mM de Ca2+ a la mezcla de reacción. El aumento de Ca2+ promovió la disociación de la calmodulina del brazo palanca de la miosina-I, reduciendo la rigidez del brazo palanca y afectando su capacidad para generar fuerza46,47,48. Bajo estas condiciones, la miosina-I permaneció dinámicamente asociada con la actina pero no soportó el deslizamiento de la actina (Figura 4A,B), lo que proporciona un control útil para evaluar efectos dependientes de la actividad del motor18.
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71259/71259fig4.jpg" /> 
Figura 4. Control basado en calcio para evaluar la actividad motora de Myo1d en el ensayo de motilidad de perlas. (A) Imágenes con el tiempo colapsado de filamentos de actina que se mueven sobre una superficie recubierta con Myo1d en ausencia de calcio elevado o formando patrones giratorios no productivos en presencia de calcio libre 100 µM. La barra de colores arcoíris indica la progresión temporal durante 61 cuadros adquiridos a intervalos de 5 s. Barra de escala, 5 µm. (B) Cuantificación de la velocidad de deslizamiento de actina en ausencia y presencia de calcio libre 100 µM (N = 2 experimentos independientes; n = 25 filamentos). No se observó deslizamiento productivo de actina en presencia de calcio libre 100 µM bajo estas condiciones. Las barras de error representan la desviación estándar (SD). (C) Pares representativos de perlas de control y perlas recubiertas con miosina ensambladas en ausencia o presencia de calcio libre 100 µM. Se muestran cinco pares representativos de perlas para cada condición. Dentro de cada par, la perla de control y la perla recubierta con miosina se imagaron en el mismo campo de visión. Las imágenes se adquirieron aproximadamente entre 15 y 20 minutos después del inicio de la reacción. El brillo y el contraste se ajustaron lineal e idénticamente dentro de cada par de perlas control–miosina, pero se escalaron independientemente entre condiciones. Condiciones de la reacción: 4 µM de actina con 5 % de actina marcada con rodamina, 200 nM del complejo de proteína relacionada con actina 2/3 (Arp2/3) y 50 nM de proteína de cierre (CP). Barras de escala, 5 µm. Los paneles A y B se reproducen/modifican de Xu et al., Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.ado5788 (2024), AAAS, con permiso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71259/71259fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Cuando el ensayo se realizó correctamente, las perlas recubiertas con miosina ensayadas en condiciones de Ca2+ elevado generaron colas cometarias de actina más cortas con densidades de red comparables a las de las perlas de control (Figura 4C). Se muestran cinco pares representativos de perlas de control y recubiertas con miosina provenientes de dos experimentos independientes. Este resultado cualitativo se observó de manera consistente en preparaciones repetidas del ensayo y está respaldado por el análisis cuantitativo informado en el estudio original18. Este resultado esperado indica que las diferencias en la red observadas bajo condiciones estándar dependen de un golpe de potencia activo de la miosina, y no únicamente del grado de ocupación de la superficie por miosina. Por lo tanto, la condición de Ca2+ elevado sirve como un control clave para evaluar si los cambios en la organización de la red de actina ramificada surgen de la actividad del motor de miosina.

Este protocolo describe un ensayo de movilidad de perlas con colas de cometa de actina ajustable para investigar cuantitativamente cómo la actividad del motor de miosina influye en el ensamblaje de actina ramificada y en la arquitectura de la red en una interfaz similar a una membrana.

Reconstitución del ensamblaje de actina ramificada mediado por miosina I en un ensayo de motilidad de colas de cometa de actina basado en microesferas

La polimerización de actina ramificada mediada por el complejo de proteínas relacionadas con la actina 2/3 (Arp2/3) proporciona las principales fuerzas de empuje para una variedad de...

Our research focuses on studying how myosin-I shapes branched actin networks and drives force generation at membrane interfaces. Previous cellular studies make it hard to isolate myosin-I effects. This protocol reconstitutes everything in vitro under well-controlled conditions.To begin, gather the required reagents. After preparing the nucleation-promoting factor, or NPF, and neutravidin coating mixture, gently mix the coating mixture by pipetting up and down 5 to 10 times, avoiding bubble formation. Transfer 5 microliters of bead slurry to a microcentrifuge tube. Add 10 microliters of X buffer to the beads and pipette at least five times. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant by tilting the tube and aspirating from the side opposite the bead pellet. Resuspend the washed beads in 50 microliters of the previously prepared coating mixture. Mix the suspension by gentle pipetting and leave a small air bubble to facilitate mixing during incubation. Incubate the beads on a benchtop rotator at 20 revolutions per minute for two hours at 4 degrees Celsius. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess neutravidin and GST-VCA. Resuspend the coated beads in 200 to 400 microliters of 10 milligrams per milliliter BSA. Incubate the suspension on ice for 30 minutes to block unoccupied binding sites on the bead surface. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant. Resuspend the beads in 50 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Remove the supernatant and repeat the wash twice. Store the coated beads in 1 milligram per milliliter BSA prepared in X buffer on ice and use them within one week.To exchange the storage X buffer with the M buffer before myosin coating, divide 50 microliters of neutravidin-NPF-coated beads equally into two microcentrifuge tubes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius and carefully remove the supernatant. Wash the beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Resuspend the control beads in 25 microliters of 1 micromolar Biotin-CF640 fluorescent dye diluted from the stock solution in M buffer. Resuspend the myosin beads in 25 microliters of 500 nanomolar to 1 micromolar biotinylated myosin supplemented with 1 to 5 micromolar calmodulin. After covering the tubes with aluminum foil, incubate the bead suspensions on ice for at least 30 minutes. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius, and carefully remove the supernatant containing excess biotinylated myosin or fluorescent dye. Wash the decorated beads with 25 microliters of 1 milligram per milliliter BSA prepared in M buffer. Pellet the beads by centrifugation at 16,000 x g for two minutes at 4 degrees Celsius. Carefully remove the supernatant and repeat the wash twice. Supplement the myosin-decorated beads with 1 to 5 micromolar calmodulin. Protect all decorated beads from light by covering the tubes with aluminum foil, then store the far-red fluorescent dye-decorated beads or myosin-decorated beads on ice.After bead preparation and decoration, prepare a 50-microliter motility mixture. Initiate the reaction by adding 4 microliters of 50 micromolar G-actin with 5% to 10% of the actin fluorescently labeled. Mix the reaction immediately and designate this time point as time equals 0. Clean the glass slide and coverslip with 70% ethanol, followed by deionized water. Plasma-clean the glass surfaces using ambient air plasma for 10 minutes. Apply 2.3 microliters of the reaction mixture to the glass slide. Place a 22-millimeter by 22-millimeter coverslip over the sample to form a squeeze chamber, with an approximate chamber height of 4.3 micrometers. Seal the chamber with vacuum grease. Using an epifluorescence microscope, acquire fluorescence images.Surface-bound NPFs stimulated branched actin assembly around the bead surface and actin first appeared as a sparse shell surrounding the bead. Continued actin assembly at the bead surface drove outward network growth, which led to symmetry breaking and the formation of a polarized comet tail. Once a comet tail was established, ongoing actin nucleation at the bead surface supported sustained bead movement. Under standard assay conditions, myosin-coated beads typically produce dimmer, sparser, or more diffuse actin comet tails than control beads.This protocol allows researchers to study how membrane-bound myosin motors regulate actin network density, growth kinetics, and polymerization-driven bead movement. The most important consideration is protein quality. Always validate new preparations against a previously validated batch before quantitative experiments. Future studies building on this work can test other membrane-associated myosins, disease-associated motor variants, or actin regulators at the membrane-like interface.

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Bioingeniería

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Reconstitución del ensamblaje de actina ramificada mediado por miosina I en un ensayo de motilidad de colas de cometa de actina basado en microesferas (Video) | JoVE Journal

Reconstitución del ensamblaje de actina ramificada mediado por miosina I en un ensayo de motilidad de colas de cometa de actina basado en microesferas

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