Imagen cuantitativa de células vivas de la forma nuclear y la dinámica de la cromatina durante el desarrollo y el estrés ambiental en la raíz de Arabidopsis thaliana
5 de junio de 2026
Este proceso utiliza microscopía confocal junto con un núcleo marcado fluorescentemente y una línea de marcadores de cromatina en Arabidopsis thaliana para registrar simultáneamente la dinámica del núcleo y la cromatina en raíces de Arabidopsis e investigar cambios en estas dinámicas en respuesta a señales de desarrollo y ambientales.
Nuestra investigación investiga genes y mecanismos que permiten la recuperación radicular a largo plazo del estrés osmótico para fortalecer los cultivos frente a la sequía. Aunque se desarrolló para raíces de arabidopsis, este protocolo puede adaptarse a sistemas con líneas marcadoras de proteínas fluorescentes. Prepara las placas de crecimiento que contienen plántulas de Arabidopsis thaliana para la imagen.
Pipetea 60 microlitros de agua pura sobre un portaobjetos de cristal. Deposita tres raíces de plántula de A. thaliana de seis días en el agua. Coloca una cubierta de 22x22 milímetros número 1,5 sobre las raíces sin cubrir las hojas.
En los ajustes del microscopio confocal, ajusta el tiempo de exposición láser a 1.000 milisegundos. En la configuración del combinador láser, ajusta el láser de 488 nanómetros al 50% para la imagen de proteína fluorescente verde, o GFP. Ajusta el láser de 561 nanómetros al 50% para la imagen de proteína fluorescente roja, o RFP.
Fotografía la muestra usando un objetivo de 20X sin zoom óptico. Ajusta el tamaño del paso de la sección Z a 0,3 micrómetros. Establece el intervalo de imagen en un minuto y la duración total de la imagen en 10 minutos.
Localiza las raíces y selecciona hasta 20 rodajas Z. Captura imágenes de 16 bits. Inicia la adquisición en time lapse y guarda el time lapse como un archivo TIFF usando compresión sin pérdida.
Mueve los datos adquiridos a un ordenador para su análisis. Abre el software ImageJ o Fiji. Haz clic y arrastra el archivo VSI a la ventana principal de ImageJ o a la aplicación Fiji.
En el prompt de Opciones de Importación de Bio Formatos, haz clic en OK en la esquina inferior derecha. Luego, en el prompt de Opciones de Serie de Formato Bio, asegúrate de que la Serie 1 esté seleccionada. Haz clic en OK en la esquina inferior izquierda.
Una vez cargada la imagen, divide las señales seleccionando Imagen. Selecciona Color y elige Dividir canales. Consulta las ventanas separadas generadas para núcleos etiquetados con GFP y cromatina etiquetada con RFP.
Determina cuál de las dos ventanas de imagen corresponde a la cromatina. Después de hacer clic en la ventana de imagen de cromatina, aplica la operación del proyecto Z seleccionando Imagen, seleccionando Pilas y luego haciendo clic en Proyecto Z desde la ventana principal de ImageJ. Cambia el tipo de proyección a máxima intensidad.
Asegúrate de que Todos los Marcos de Tiempo esté activo y haz clic en Aceptar para generar la proyección. Abre el menú de contraste pulsando Control Shift C, o seleccionando Imagen y ajustar, y luego haz clic en Brillo o Contraste desde la ventana principal de ImageJ. Desplace la barra mínima hacia la izquierda hasta que la cromatina sea claramente visible.
Navega hasta los plugins. Haz clic en la flecha hacia abajo en el menú de Plugins para desplazarte hasta la opción de Seguimiento. Selecciona Seguimiento y haz clic en Compañero de Seguimiento.
Confirma que la configuración de calibración es correcta y haz clic en Siguiente. Selecciona Detector de umbral y haz clic en Siguiente. Pasar al último fotograma del time lapse en la ventana de imagen.
Haz clic en Auto junto al umbral de intensidad y haz clic en Vista previa. Ajusta el umbral de intensidad y haz clic en Previsualización. Repite el proceso de ajuste y previsualización hasta que toda la cromatina esté incluida con el mínimo ruido, y haz clic en Siguiente.
Permite que la detección inicial de umbral se complete y haz clic en Siguiente. Ajusta manualmente el umbral hasta que solo se vea la cromatina y haz clic en Siguiente. Ajusta la pantalla de imagen de fluorescencia y haz clic en Siguiente.
Selecciona Simple LAP Tracker y haz clic en Siguiente. Configura la distancia máxima de enlace a 5 micras, la distancia máxima de cierre a 15 micras, la distancia máxima de cierre a 1, y haz clic en siguiente. Permite que el seguimiento se complete.
Observa las pistas que aparecen en la ventana original y haz clic en Siguiente. Pulsa el botón verde más en la esquina inferior izquierda para crear un filtro. Selecciona el número de plazas en el modo pista.
Ajusta el control deslizante del umbral. Asegúrate de que el modo de filtro esté configurado en Arriba y luego haz clic en Siguiente. Haz clic en el botón Tracks en la parte inferior de la página de Opciones de Visualización.
Selecciona Exportar a CSV. Ignora la página de trazado integrada y haz clic en Siguiente. Revisa los resultados del análisis de TrackMate.
Haz clic en Capturar Superposición y luego elige Ejecutar. Guarda el vídeo seleccionando Archivo y haciendo clic en Guardar como, y luego eligiendo GIF. Las células radiculares tratadas con sal parecían estresadas, y los focos centróricos parecían mayores que en condiciones de control.
La velocidad de la cromatina fue significativamente mayor en condiciones de control que en condiciones tratadas con cloruro de sodio de 100 milimolares. Este protocolo permite el seguimiento y cuantificación del movimiento de proteínas marcadas por fluorescencia a lo largo del tiempo en raíces de arabidopsis. El desafío más importante de este protocolo es obtener imágenes de alta calidad, ya que el blanqueo fotográfico y la deriva de la muestra pueden dificultar el seguimiento.
Futuros estudios deberían investigar los mecanismos subyacentes a la reducción del movimiento de la cromatina observada en nuestro estudio.
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Overview
The nucleus in eukaryotic cells exhibits dynamic shape changes, which are altered under stress conditions such as cancer in animals or abiotic stress in plants. This study developed a live-cell imaging pipeline in Arabidopsis thaliana roots using dual fluorescent markers for the nuclear envelope and chromatin to quantify nuclear and chromatin dynamics under control and salt-stressed conditions. Confocal microscopy combined with Fiji/ImageJ and TrackMate enabled quantitative analysis, revealing reduced chromatin movement under salt stress. The method provides a robust approach to study how abiotic stressors affect nuclear architecture and chromatin dynamics in plant cells.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Nuclear dynamics
- Chromatin mobility
- Abiotic stress response
Background
- Nuclear shape is dynamic in live cells, not static as traditionally depicted.
- Altered nuclear morphology is associated with cancer in animal cells and environmental stress in plants.
- The nuclear envelope interacts with chromatin to influence gene expression.
- Limited knowledge exists on how abiotic stress affects nuclear shape, movement, and chromatin dynamics in plants.
Purpose of Study
- To develop a pipeline for quantifying nuclear and chromatin dynamics in live plant cells.
- To apply this method to assess changes under abiotic stress, specifically salt stress.
- To validate the approach by measuring chromatin movement in control and stressed conditions.
- To enable future analysis of nuclear and chromatin responses to environmental stressors in Arabidopsis roots.
Methods Used
- Live-cell imaging of Arabidopsis thaliana roots using confocal microscopy.
- Use of a dual fluorescently tagged marker line (nuclear envelope protein and chromatin).
- Image acquisition under control and salt-stressed conditions.
- Analysis of nuclear and chromatin dynamics using Fiji/ImageJ with the TrackMate plugin.
- Particle tracking to quantify chromatin speed and movement.
Main Results
- Chromatin movement was significantly reduced in salt-stressed roots compared to control.
- The dual-tagging system allowed simultaneous visualization of nuclear envelope and chromatin.
- TrackMate enabled accurate particle tracking and quantification of dynamics.
- The method successfully captured live, quantitative changes in nuclear and chromatin behavior.
Conclusions
- The developed pipeline allows for quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in plant roots.
- Salt stress leads to decreased chromatin mobility, indicating altered nuclear dynamics under abiotic stress.
- This approach can be applied to study nuclear responses to various environmental stressors.
- The method provides a foundation for linking nuclear architecture to gene regulation and stress adaptation in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative live-cell imaging of nuclear shape and chromatin dynamics in Arabidopsis roots provides a robust platform for dissecting cellular responses to environmental stress at high resolution. This approach enables predictive confidence in linking nuclear architecture changes to gene regulation, supporting early discovery and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. The method's quantitative outputs facilitate risk-adjusted decisions for trait development and stress adaptation research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nuclear and chromatin behavior under defined stress conditions.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying dynamic nuclear responses to abiotic stimuli.
- Facilitates functional validation of nuclear envelope and chromatin-associated targets.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative imaging assays for nuclear and chromatin dynamics.
- Enables reproducible measurement of stress-induced changes in live plant cells.
- Supports scalable screening of genetic or chemical modulators affecting nuclear architecture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nuclear and chromatin dynamics with stress adaptation phenotypes in model systems.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of stress resilience traits.
- Supports predictive de-risking for translational research in crop improvement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis pipeline integrates from early discovery through screening and translational research in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Quantifies nuclear and chromatin dynamics to clarify stress response pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides particle tracking and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Links nuclear architecture changes to stress adaptation, supporting trait validation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse plant models and stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nuclear and chromatin target validation.
- Operational Value: Standardizes live-cell imaging and quantitative analysis for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for stress adaptation trait development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic or chemical interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and live-cell imaging.
- Needs access to dual fluorescent marker lines and image analysis software (Fiji/ImageJ, TrackMate).
- Demands cross-team standardization for imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to other plant species with suitable marker development.
- Limited by availability of compatible fluorescent markers for target systems.
