Caracterización funcional de parejas pre- y postsinápticas individuales en el sistema nervioso central larvario de Drosophila usando CaMPARI

Nuestra investigación se centra en evaluar la conectividad sináptica funcional entre compañeros gandularios neuronales definidos en larvas vivas y diseccionadas de Drosophila. Los métodos convencionales requieren disección o estimulación física. Este protocolo utiliza optogenética en larvas intactas, reduciendo los artefactos.

Para empezar, derrite el medio de ágar de harina de maíz en el microondas durante 8-10 segundos sin hervir y déjalo enfriar a temperatura ambiente sin solidificarse. Antes de enfriar completamente, añadir all-trans-retinal, o ATR, a una concentración de 0,5 milimolar para complementar el medio para las moscas que requieren activación de csChrimson. Cubre completamente los frascos con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.

Cruzar hembras vírgenes portadoras de los genes CaMPARI y csChrimson con machos portadores de los genes conductores GAL4 y LexA en viales de plástico que contienen el medio preparado. Prepara viales paralelos sin ATR como control. Incubar los viales a 25 grados Celsius hasta que las larvas alcancen la etapa de tercer estadio.

Usa un pincel para recoger una larva de tercer estadio. Enjuaga la larva en una placa micro puntual de tres pozos que contiene 0,1 molares de PBS para eliminar cualquier alimento adherido. Coloca una pequeña cantidad de plastilina en cada esquina de una funda limpia de 18 x 18 milímetros.

Coloca la larva en una gota de PBS sobre la cubierta y deja que se oriente con el lado ventral hacia abajo. Coloca una lámina limpia sobre la cubierta que contiene la larva. Asegura la capa de cubierta aplicando plastilina en las esquinas, usando la presión justa para inmovilizar la larva sin aplastarla ni romper el cristal.

Colocar la lámina que contiene la larva en el escenario de un microscopio confocal equipado con una lente objetivo de 40x/1.2. En la interfaz del software del microscopio, haz clic en Live. Luego, en el panel de Pila Z, haz clic en Establecer Primero y luego en Establecer Último seguido de Detenerse para adquirir una pila base Z de neuronas postsinápticas que expresan CaMPARI.

En el menú de Canales, configura el canal verde de 488 nanómetros con un 0,8% de potencia láser. A continuación, ajusta el canal rojo de 561 nanómetros al 0,8% de potencia láser. En el menú Z Stack, establece el valor de Intervalo a 1 micrómetro.

En el menú de Adquisición, selecciona Presets para establecer la resolución de 256 x 256 píxeles. Un valor promedio de línea de 2, escaneo bidireccional y una velocidad de escaneo de 9, que permite la actualización automática del tiempo de píxel. Realizar todas las imágenes en un entorno oscuro, manteniendo parámetros de adquisición idénticos durante todo el experimento.

Ajusta la luz de fotoconversión de 405 nanómetros al 0,5% de potencia láser. Y la luz optogenética de 561 nanómetros para estimulación optogenética al 0,8% de potencia láser. Haz clic en Live, luego selecciona Mejor ajuste en el panel de Histograma.

Permite que ambos láseres estimulen simultáneamente a la larva durante 30 segundos y luego detén la estimulación. Durante la adquisición de ZStack tras la estimulación utilizando los mismos parámetros que la línea base, observa fluorescencia roja de CaMPARI en neuronas estimuladas con láser de larvas alimentadas con ATR, con fotoconversión y controles mínimos. En el software Fiji ImageJ, haz clic en Archivo y luego elige Abrir.

En la ventana de opciones de importación de BioFormats con la configuración predeterminada, haz clic en OK para abrir la imagen adquirida de ZStack. En el menú Imagen, elige Color y luego Divide Canales para ver los canales rojo y verde de la imagen adquirida. Para restar fondo, haz clic en Procesar y luego selecciona Restar fondo.

En la ventana emergente, configura el radio de la bola rodante a 50 píxeles y luego haz clic en Aceptar y selecciona Sí en la ventana de Pila de Procesos. A continuación, en el menú Analizar, selecciona Herramientas y luego elige Administrador de ROI para abrir la ventana de ROI. Utiliza la herramienta de selección a mano alzada para delinear las regiones de interés alrededor de las células individuales.

En la ventana de ROI, selecciona Añadir para guardar el esquema seleccionado. Luego haz clic en Medir para generar resultados de área, media, desviación estándar e integrados de densidad. Repitiendo el proceso para varias células de la misma larva a través de los canales verde y rojo por separado.

Después de exportar los resultados a una hoja de cálculo, mide la relación rojo a verde o R por G de las densidades integradas para cada célula, y promedia estos valores para calcular la media R por G por larva tanto para las imágenes pre como post-estimulación. Finalmente, calcular el cambio en la fluorescencia o delta R por G restando la relación R por G antes de la estimulación R por G para cuantificar la actividad calciosa postsináptica. Los estudios de conectividad funcional entre neuronas de arborización dendrítica de clase IV o cIVda y las interneuronas de la cuenca-4 en larvas de tercer estadio mostraron que las interneuronas de la cuenca-4 mostraban fluorescencia verde debido a la expresión citosólica de CaMPARI antes de la fotoconversión y la estimulación óptica de la luz.

No se detectó fluorescencia roja bajo condiciones iniciales, lo que confirmó la ausencia de fotoconversión antes de la estimulación. La exposición simultánea a la luz fotoconversión y la estimulación optogenética resultaron en la fotoconversión CaMPARI de fluorescencia verde a roja. La ausencia de fluorescencia roja en el control indica que la fotoconversión fue impulsada específicamente por la actividad neuronal mediada por csChrimson.

La fluorescencia delta roja por verde fue significativamente mayor en animales experimentales que en ningún control ATR. Este protocolo puede utilizarse para confirmar la asociación sináptica permitiendo el seguimiento de la estimulación presináptica seguida de respuestas postsinápticas inmediatas en animales en desarrollo vivo. El paso más desafiante es que una inmovilización adecuada del animal requerirá suficiente presión para evitar el movimiento sin dañarlo.

Futuros estudios podrían permitir el seguimiento, la formación, el fortalecimiento e incluso la eliminación de conexiones sinápticas entre poblaciones neuronales específicas durante el desarrollo de un animal.