ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Centro de Biología del Cáncer y Terapéutica de Precisión, Universidad Médica de China, dentro del Programa de Centros de Investigación de Áreas Destacadas en el marco del Proyecto Brotes de Educación Superior del Ministerio de Educación (MOE) en Taiwán (CBPTC-PROJ-5-2).
Agradecemos al Centro de Biología del Cáncer y Terapéutica de Precisión por proporcionar financiamiento y apoyo académico.

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2020:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Perou, C. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+portraits+of+human+breast+tumours.">Molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).</li><li>Foulkes, W. D., Smith, I. E., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer.">Triple-negative breast cancer.</a> N Engl J Med. 363 (20), 1938-1948 (2010).</li><li>Dent, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-negative+breast+cancer:+Clinical+features+and+patterns+of+recurrence.">Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence.</a> Clin Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4429-4434 (2007).</li><li>Lin, N. U., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sites+of+distant+recurrence+and+clinical+outcomes+in+patients+with+metastatic+triple-negative+breast+cancer:+High+incidence+of+central+nervous+system+metastases.">Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases.</a> Cancer. 113 (10), 2638-2645 (2008).</li><li>Bianchini, G., De Angelis, C., Licata, L., Gianni, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+landscape+of+triple-negative+breast+cancer+-+expanded+options,+evolving+needs.">Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs.</a> Nat Rev Clin Oncol. 19 (2), 91-113 (2022).</li><li>Lecoultre, M., Dutoit, V., Walker, P. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+function+of+tumor-associated+macrophages+as+a+key+determinant+of+tumor+progression+control:+A+review.">Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review.</a> J Immunother Cancer. 8 (2), (2020).</li><li>Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+as+tools+and+targets+in+cancer+therapy.">Macrophages as tools and targets in cancer therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).</li><li>Chan, S. H., Lin, C. Y., Tseng, H. J., Wang, L. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd24a+knockout+results+in+an+enhanced+macrophage-+and+cd8&#x207A;+t+cell-mediated+anti-tumor+immune+responses+in+tumor+microenvironment+in+a+murine+triple-negative+breast+cancer+model.">Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8&#x207A; t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model.</a> J Biomed Sci. 32 (1), 73 (2025).</li><li>Majeti, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD47+is+an+adverse+prognostic+factor+and+therapeutic+antibody+target+on+human+acute+myeloid+leukemia+stem+cells.">CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells.</a> Cell. 138 (2), 286-299 (2009).</li><li>Barkal, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD24+signalling+through+macrophage+siglec-10+is+a+target+for+cancer+immunotherapy.">CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy.</a> Nature. 572 (7769), 392-396 (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD24-siglec+axis+is+an+innate+immune+checkpoint+against+metaflammation+and+metabolic+disorder.">CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder.</a> Cell Metab. 34 (8), 1088-1103.e6 (2022).</li><li>Chan, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+novel+role+of+CD24+as+an+oncogenesis+regulator+and+therapeutic+target+for+triple-negative+breast+cancer.">Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. 18 (1), 147-161 (2019).</li><li>Huang, S., Zhang, X., Wei, Y., Xiao, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoint+CD24+function+on+tumor+and+immunotherapy.">Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy.</a> Front Immunol. 15, 1367959 (2024).</li><li>Weiskopf, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+critical+effectors+of+antibody+therapies+for+cancer.">Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer.</a> MAbs. 7 (2), 303-310 (2015).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+antibody-dependent+cellular+phagocytosis+for+effective+macrophage-based+cancer+immunotherapy.">Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy.</a> Sci Adv. 8 (11), eabl9171 (2022).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev Immunol. 17, 593-623 (1999).</li><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Denardo, D. G., Ruffell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+as+regulators+of+tumour+immunity+and+immunotherapy.">Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 19 (6), 369-382 (2019).</li><li>Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg, A. C., Hanley, P. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+3d+imaging+of+phagocytosis+by+mouse+macrophages.">Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages.</a> J Vis Exp. (140), e57566 (2018).</li></ol>

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Varios pasos en este protocolo son fundamentales para obtener resultados confiables y reproducibles. En primer lugar, la calidad y pureza del aislamiento de PBMC influyen directamente en el rendimiento de macrófagos y en la eficiencia de diferenciación. Es esencial realizar un cuidadoso estratificado de sangre diluida sobre el gradiente de Ficoll y una centrifugación con el freno desactivado para preservar la interfase del capa blanca. Una lisis incompleta de glóbulos rojos o una incubación excesiva con el tampón de lisi...

El cáncer de mama es la malignidad más frecuentemente diagnosticada en mujeres a nivel mundial, representando aproximadamente 2,3 millones de nuevos casos anualmente1. La enfermedad es clínicamente heterogénea y se clasifica en al menos cuatro subtipos moleculares principales según el estado de los receptores hormonales: receptor de estrógeno (ER) y receptor de progesterona (PR), así como la expresión del oncogén del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2)2. Los tumores luminales A expresan ER y/o PR sin sobreexpresión de HER2 (ER/PR+ y HER2−); los tumores luminales B expresan simultáneamente ER/PR y HER2 (ER/PR+ y HER2+); los tumores HER2+ se caracterizan por una alta expresión de HER2 independientemente del estado de los receptores hormonales; y el cáncer de mama triple negativo (TNBC) carece de expresión de los tres marcadores (ER−, PR− y HER2−)2,3. Entre estos subtipos, el TNBC representa la forma clínicamente más desafiante y constituye aproximadamente del 15 % al 20 % de todos los cánceres de mama. Los pacientes con TNBC presentan el curso de enfermedad más agresivo, con el peor pronóstico y la menor supervivencia general a 5 años, debido a la escasa respuesta a la quimioterapia convencional y a la ausencia de terapias dirigidas efectivas3,4. Además, el TNBC muestra una marcada tendencia a la metástasis visceral, particularmente hacia los pulmones dentro de los 5 años posteriores al diagnóstico, y los pacientes con TNBC avanzado o metastásico (mTNBC) tienen una supervivencia mediana que rara vez supera los 2 años5,6. Estas estadísticas subrayan la necesidad crítica e insatisfecha de nuevas estrategias terapéuticas para el TNBC.
El microambiente tumoral (TME) desempeña un papel fundamental en la progresión del cáncer de mama y en la evasión inmunitaria. Los macrófagos asociados al tumor se encuentran entre las células inmunitarias más abundantes dentro del TME y recientemente han sido reconocidos como mediadores críticos de la inmunidad innata contra el tumor7,8,9. Aunque históricamente los macrófagos asociados al tumor se dividían en estados «M1» proinflamatorios y «M2» protumorales, este modelo binario no logra capturar la verdadera heterogeneidad de los macrófagos. Por el contrario, los macrófagos asociados al tumor ocupan un espectro funcional dinámico, que evoluciona en respuesta a las diversas señales bioquímicas presentes en el TME. En este complejo entorno, las células cancerosas subvierten activamente la actividad de los macrófagos mediante diversas estrategias de evasión inmunitaria, especialmente la sobreexpresión de señales de «no me comas». El eje CD47/SIRPα fue la primera señal de control inmunitario innato identificado en este contexto6,10, y más recientemente, el CD24 ha surgido como una señal antifagocítica novedosa y potente11,12. El CD24 es una pequeña glucoproteína tipo mucina, altamente glicosilada, anclada a la membrana celular mediante un enlace fosfatidilinositol glucosilado13. Se expresa en diversas linajes de células inmunitarias en condiciones fisiológicas, pero con frecuencia está sobreexpresado en tumores sólidos, incluyendo cánceres de mama, ovárico, pancreático y colorrectal14. En las células tumorales, el CD24 se une al receptor inhibitorio denominado lectina tipo inmunoglobulina que se une a ácido siálico 10 (Siglec-10), expresado en los macrófagos. Esta interacción desencadena la fosforilación de los dominios de motivos inhibitorios basados en tirosina del inmunorreceptor en la cola citoplasmática del Siglec-10, activando las fosfatasas SHP-1 y SHP-2 que suprimen la señalización fagocítica descendente11. Se ha demostrado que la inhibición de la interacción CD24/Siglec-10 mediante un anticuerpo monoclonal aumenta considerablemente la fagocitosis de tumores humanos que expresan CD24 por parte de los macrófagos. Nuestro estudio reciente también mostró que la eliminación del CD24a en células de cáncer de mama incrementa su susceptibilidad a la fagocitosis por macrófagos en un modelo murino de cáncer de mama triple negativo9.
La fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) es un mecanismo fundamental mediante el cual los anticuerpos dirigen a los macrófagos para que fagociten células tumorales15,16. Tras unirse a antígenos expresados en las células tumorales, la región Fc del anticuerpo interactúa con los receptores Fcγ (FcγR) en los macrófagos, desencadenando cascadas de señalización intracelular que culminan en la reorganización del citoesqueleto, la formación de la copa fagocítica y la internalización de la célula diana17.
En este estudio, desarrollamos y validamos un protocolo de imagenología de células vivas con lapso de tiempo para medir la fagocitosis de células de cáncer de mama mediada por anticuerpos en macrófagos. El método utiliza macrófagos derivados de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes humanos sanos, diferenciados con factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y posteriormente estimulados con lipopolisacárido (LPS) e interferón gamma (IFN-γ). El análisis mediante citometría de flujo confirmó la sobreexpresión de CD80 dentro de la población CD11b⁺ tras la estimulación (Figura 1), lo que respalda el fenotipo clásicamente activado. Este estado de activación confiere una capacidad robusta de fagocitosis mediada por anticuerpos, lo que lo hace adecuado para evaluar la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). Las células diana son células de cáncer de mama positivas para CD24 marcadas con GFP, que se opsonizan con un anticuerpo monoclonal terapéutico anti-CD24 antes de la co-cultura. Los eventos fagocíticos se registran durante un período de 16 h mediante un microscopio automatizado bajo condiciones ambientales controladas. Para permitir una evaluación cuantitativa paralela a la visualización dinámica, se realiza un ensayo independiente de punto final bajo condiciones idénticas de co-cultura, lo que permite una medición rigurosa de la fagocitosis tras la eliminación de las células diana no internalizadas. Este protocolo proporciona una plataforma estandarizada, reproducible y visualmente informativa para evaluar la ADCP mediada por un anticuerpo anti-CD24. Es importante destacar que la integración de la imagenología con lapso de tiempo con una estrategia complementaria de cuantificación basada en puntos finales permite la evaluación simultánea de la cinética y la magnitud de la fagocitosis. El método puede adaptarse para investigar otros blancos inmunoterapéuticos dirigidos a macrófagos. Este protocolo es especialmente adecuado para evaluar la ADCP mediada por anticuerpos monoclonales terapéuticos contra antígenos de superficie en células cancerosas. Es ideal para la selección comparativa de anticuerpos candidatos, la caracterización de respuesta a la dosis y estudios mecanicistas del acoplamiento Fc–FcγR, incluyendo los efectos del bloqueo de la señal «no me comas» (por ejemplo, CD47–SIRPα). Dado que el ensayo utiliza macrófagos humanos primarios, también es apropiado para estudios traslacionales que requieran evaluar la variabilidad entre donantes antes del desarrollo clínico.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71461/71461fig1.jpg" /> 
Figura 1. Generación y validación mediante citometría de flujo de macrófagos estimulados con IFN-γ/LPS derivados de células mononucleares de sangre periférica. Panel superior: Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aíslan de donantes sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando solución de Ficoll a 400 × g durante 30 min a 20°C, con todos los reactivos pre-equilibrados a 20°C ± 2°C. Las PBMCs aisladas se cultivan en medio ImmunoCult-SF suplementado con 100 ng/mL de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) durante 7 días para inducir la diferenciación a macrófagos (Día 0–7), con suplementación del medio al día 5. Al día 8, los macrófagos diferenciados se estimulan con 100 ng/mL de IFN-γ y 1 µg/mL de LPS durante 48 h (Día 8–10). Posteriormente, las células se someten a análisis por citometría de flujo. Panel inferior: Análisis por citometría de flujo de macrófagos. Las células se tiñeron con un panel de superficie compuesto por CD11b-FITC, CD80-PE y CD206-PerCP-Cy5.5, seguido de la adición de DAPI antes de la adquisición para excluir células muertas. Estrategia de selección: Primero, las células se seleccionaron según viabilidad (DAPI⁻), seguido de la identificación de CD11b⁺ en un gráfico de CD11b-FITC versus FSC-A para confirmar la identidad de macrófago. Los eventos viables CD11b⁺ se analizaron luego en un gráfico de puntos de CD80 versus CD206 para confirmar la población CD80⁺CD206⁻ inducida por la estimulación con IFN-γ/LPS. Derecha: Gráfico de puntos representativo de CD11b-FITC versus FSC-A que muestra que el 99,8 % de las células seleccionadas fueron CD11b⁺, confirmando la identidad de macrófago. Izquierda: La mayoría de las células CD11b⁺ se ubicaron dentro de la puerta CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95,2 %), lo que indica el fenotipo proinflamatorio esperado bajo las condiciones de estimulación aplicadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71461/71461fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los usuarios deben considerar varias limitaciones al aplicar esta técnica. Primero, la variabilidad entre donantes en los macrófagos derivados de PBMC puede introducir una varianza considerable en la actividad fagocítica, y recomendamos utilizar múltiples donantes (n ≥ 3), informando los datos de cada donante individual junto con los resultados agrupados. Segundo, el formato de co-cultivo en 2D no reproduce el microambiente tumoral, por lo que los hallazgos deben validarse en modelos en 3D o in vivo antes de realizar inferencias clínicas. Tercero, la ventana de imagen de 16 horas captura eventos fagocíticos tempranos, pero no refleja procesos a más largo plazo, como la presentación de antígenos o la activación inmune secundaria. Por lo tanto, el uso combinado de imágenes en tiempo real y cuantificación en el punto final proporciona un marco complementario que mejora la interpretabilidad y la reproducibilidad de las mediciones de ADCP.

<table><tbody><tr><td>Solución stock de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M</td><td>Sigma-Aldrich (o equivalente)</td><td>E7889 (o equivalente)</td><td>Utilizado para preparar una solución de trabajo de EDTA 10 mM en PBS para la disociación celular</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 24 pocillos (tratadas para cultivo tisular)</td><td>Corning (o equivalente)</td><td>3524</td><td>Utilizado para el cultivo conjunto de macrófagos y células cancerosas durante el ensayo de fagocitosis</td></tr><tr><td>Anticuerpo antihumano CD206 (citometría de flujo)</td><td>BioLegend (o equivalente)</td><td>321122 (o equivalente)</td><td>Marcador para el fenotipo alternativo de macrófagos</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-CD24 humano</td><td>Thermo Fisher Scientific (o equivalente)</td><td>MA1-91384 (o equivalente)</td><td>Utilizado para opsonizar células cancerosas para la fagocitosis dependiente de anticuerpos</td></tr><tr><td>Sistema automatizado de imagenología en células vivas con cámara de control ambiental (por ejemplo, Lionheart FX)</td><td>Agilent Technologies (o equivalente)</td><td>Microscopio automático BioTek Lionheart FX</td><td>Permite la obtención de imágenes de lapso de tiempo prolongado bajo temperatura controlada y &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; condiciones</td></tr><tr><td>Software de imagen para microscopía automatizada de células vivas (por ejemplo, Gen5)</td><td>Agilent Technologies (o equivalente)</td><td>N/A</td><td>Utilizado para la adquisición y el análisis de datos de imágenes de lapso de tiempo</td></tr><tr><td>Centrífuga (rotor de cubeta oscilante)</td><td>Thermo Fisher Scientific (o equivalente)</td><td>Multifuge X4R Pro con rotor TX-1000 (o equivalente)</td><td>Utilizado para el aislamiento de PBMC y los pasos de lavado celular</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubadora (37&amp;deg;C, 5% &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (o equivalente)</td><td>Forma Direct Heat &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubadora (o equivalente)</td><td>Mantiene condiciones fisiológicas para el cultivo celular</td></tr><tr><td>&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; suministro de gas con regulador</td><td>Agilent Technologies (o equivalente)</td><td>N/A</td><td>Suministros &lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; para control ambiental del incubador y del sistema de imagen</td></tr><tr><td>Tubos cónicos (15 mL y 50 mL)</td><td>Corning (o equivalente)</td><td>352070 (o equivalente)</td><td>Utilizado para el aislamiento, lavado y centrifugación de PBMC</td></tr><tr><td>Tubos para la recolección de sangre recubiertos con EDTA (vacutainer)</td><td>BD Biosciences (o equivalente)</td><td>367863 (o equivalente)</td><td>Utilizado para la recolección de muestras de sangre completa de donantes</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva (o equivalente)</td><td>17144003 (o equivalente)</td><td>Medio de gradiente de densidad para el aislamiento de PBMCs</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo (por ejemplo, FACSCanto II)</td><td>BD Biosciences (o equivalente)</td><td>BD FACSCanto II&amp;nbsp;</td><td>Utilizado para el análisis fenotípico de macrófagos</td></tr><tr><td>Perlas de compensación (citometría de flujo)</td><td>Biolegend (o equivalente)</td><td>424602</td><td>Utilizado para controles de compensación de un solo color</td></tr><tr><td>anticuerpo FITC anti-CD11b humano (citometría de flujo)</td><td>BioLegend (o equivalente)</td><td>101205 (o equivalente)</td><td>Marcador utilizado para identificar macrófagos</td></tr><tr><td>anticuerpo PE anti-CD80 humano (citometría de flujo)</td><td>BioLegend (o equivalente)</td><td>375410 (o equivalente)</td><td>Marcador asociado con el fenotipo de macrófago activado</td></tr><tr><td>Línea celular de cáncer de mama que expresa GFP (MDA-MB-468)</td><td>ATCC (o equivalente)</td><td>HTB-132 (o equivalente)</td><td>Células diana utilizadas en el ensayo de fagocitosis; la GFP permite la visualización</td></tr><tr><td>Medio para macrófagos ImmunoCult-SF</td><td>STEMCELL Technologies (o equivalente)</td><td>10961 (o equivalente)</td><td>Medio libre de suero utilizado para la diferenciación de macrófagos</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;Medio de Eagle modificado (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (o equivalente)</td><td>12100046</td><td>Utilizado para el cultivo y resuspensión de células cancerosas</td></tr><tr><td>Anticuerpo de control de isotipo (IgG)</td><td>Bio X Cell (o equivalente)</td><td>BE0297 (o equivalente)</td><td>Control negativo para el ensayo de fagocitosis dependiente de anticuerpos</td></tr><tr><td>Lipopolisacárido (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich (o equivalente)</td><td>L2630 (o equivalente)</td><td>Estímulo utilizado para activar macrófagos en combinación con IFN-&amp;gamma;</td></tr><tr><td>Interferón gamma humano recombinante (IFN-&amp;gamma;)</td><td>STEMCELL Technologies (o equivalente)</td><td>78020 (o equivalente)</td><td>Citocina utilizada para la activación de macrófagos</td></tr><tr><td>Factor estimulante de colonias de macrófagos recombinante humano (M-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies (o equivalente)</td><td>78057 (o equivalente)</td><td>Factor de crecimiento utilizado para la diferenciación de macrófagos</td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur o pipetas serológicas</td><td>Jetbiofil (o equivalente)</td><td>GSP010010 (o equivalente)</td><td>Utilizado para el manejo de líquidos durante el aislamiento de PBMC y el cultivo celular</td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-libre</td><td>Thermo Fisher Scientific (o equivalente)</td><td>BP399-500 (o equivalente)</td><td>Tampón utilizado para el lavado de células y los pasos de dilución</td></tr><tr><td>Placas de Petri (100 mm, no&amp;ndash;tratado para cultivo de tejidos</td><td>Corning (o equivalente)</td><td>430591</td><td>Utilizado para la diferenciación de macrófagos mediante selección por adherencia</td></tr><tr><td>Buffer de lisis de glóbulos rojos (GR)</td><td>BioLegend (o equivalente)</td><td>420301 (o equivalente)</td><td>Utilizado para eliminar glóbulos rojos durante el aislamiento de PBMC</td></tr><tr><td>Colorante fijable Viobility 405/452</td><td>Miltenyi Biotec (o equivalente)</td><td>130-130-404 (o equivalente)</td><td>Utilizado para evaluar la viabilidad celular durante el análisis de citometría de flujo</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich (o equivalente)</td><td>D9542 (o equivalente)</td><td>Utilizado para la exclusión de células muertas en citometría de flujo</td></tr></tbody></table>

imágenes de lapso de tiempo de la fagocitosis de células de cáncer de mama triple negativo marcadas con proteína de fluorescencia verde por macrófagos mediada por anticuerpos

Time-Lapse Imaging of Antibody-Driven Macrophage Phagocytosis of Green Fluorescence Protein&#8211;Labeled Triple-Negative Breast Cancer Cells

La fagocitosis celular dependiente de anticuerpos es un mecanismo clave mediante el cual los macrófagos engloban células cancerosas opsonizadas con anticuerpos. Este protocolo describe un método de imágenes en vivo con lapso de tiempo para visualizar la fagocitosis mediada por macrófagos dependiente de anticuerpos en células de cáncer de mama triple negativo que expresan la proteína verde fluorescente y CD24. Los macrófagos se obtienen a partir de células mononucleares de sangre periférica humana, se diferencian con factor estimulante de colonias de macrófagos y se polarizan usando interferón gamma y lipopolisacárido para generar un fenotipo proinflamatorio. Las células cancerosas se opsonizan con un anticuerpo monoclonal anti-CD24 antes de la co-cultura con macrófagos a una proporción definida de efector a blanco. Los eventos fagocíticos se registran durante un período de 16 h mediante un microscopio automatizado equipado con control ambiental para mantener condiciones fisiológicas. Las imágenes se obtienen mediante canales de campo claro y fluorescencia, lo que permite identificar las células cancerosas y monitorear su internalización por los macrófagos. Imágenes representativas con lapso de tiempo muestran el englobamiento progresivo de células cancerosas fluorescentes a lo largo del tiempo. Para permitir una evaluación cuantitativa, se realiza un ensayo paralelo de punto final bajo condiciones idénticas de co-cultura, en el cual se eliminan las células cancerosas no internalizadas antes del análisis de imágenes, permitiendo una medición precisa de los eventos fagocíticos. Este método proporciona un enfoque estandarizado y reproducible para visualizar in vitro la fagocitosis mediada por anticuerpos en macrófagos. Es importante destacar que la integración de imágenes con lapso de tiempo con cuantificación basada en puntos finales permite una evaluación complementaria de la cinética y la magnitud de la fagocitosis. Este protocolo facilita la evaluación de anticuerpos terapéuticos y terapias inmunológicas contra el cáncer dirigidas a macrófagos en un entorno in vitro controlado.

Se confirmó con éxito la generación y polarización de macrófagos a partir de PBMC mediante evaluación morfológica y análisis de citometría de flujo (Figura 1). Los PBMC aislados mediante centrifugación en gradiente de densidad se cultivaron en medio suplementado con M-CSF, obteniéndose células adherentes con morfología característica de macrófagos para el día 7. Tras la estimulación con IFN-γ y LPS, las células mostraron un fenotipo consistente con la activación bajo las condiciones aplicada...

Este protocolo describe un método de imagenología con células vivas y lapso de tiempo para visualizar la fagocitosis de células de cáncer de mama triple negativo marcadas con proteína verde fluorescente por macrófagos derivados de células mononucleares de sangre periférica, mediante el uso de un microscopio automatizado.

Imágenes de lapso de tiempo de la fagocitosis de células de cáncer de mama triple negativo marcadas con proteína de fluorescencia verde por macrófagos mediada por anticuerpos

La fagocitosis celular dependiente de anticuerpos es un mecanismo clave mediante el cual los macrófagos engullen células cancerosas opsonizadas por anticuerpos. Este protocolo describe un...

time-lapse-imaging-antibody-driven-macrophage-phagocytosis-green

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Este video muestra un ensayo para monitorear eventos independientes de fagocitosis de glóbulos rojos (RBC) mediados por macrófagos. Los glóbulos rojos humanos opsonizados con inmunoglobulina G (IgG) de ratón se incuban con macrófagos de ratón y se observan al microscopio confocal. Los glóbulos rojos son engullidos por los macrófagos a través de una formación de copas fagocíticas y se dirigen a la degradación lisosomal.

Imágenes en tiempo real de la fagocitosis de macrófagos de glóbulos rojos opsonizados con IgG

Se describe un método para la formación de imágenes respuesta a tratamiento contra el...

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la fagocitosis de partículas fluorescentes por una línea celular de macrófagos adherentes utilizando un método fluorométrico. Este método facilita una cuantificación de alto rendimiento de la internalización de partículas, así como la polimerización de actina resultante.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar extendida time-lapse de las interacciones multicelulares en tiempo real, en vivo a una resolución de una sola célula.

Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

Aquí describimos el modelo y el enfoque para estudiar las funciones de los macrófagos alveolares pulmonares en la metástasis del cáncer. Para demostrar el papel de estas células en la metástasis, se utilizó el modelo singénico (4T1) de cáncer de mama junto con la depleción de macrófagos alveolares con liposomas de clodronato.

El estudio de la función de los macrófagos alveolares en cáncer de mama metástasis

Describimos una configuración experimental para visualizar con una formación y cierre de fagosomas de alta resolución sin precedentes en tres dimensiones en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Permite el seguimiento de la base de la copa fagocítica, los pseudópodos en expansión, así como el sitio preciso de la escisión del fagosoma.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

En este estudio se tomó la imagen de la actividad fagocítica de macrófagos contra las células cancerosas, específicamente las células del carcinoma mamario del ratón 4T1. El modelo de cocultivo de células vivas se estableció y observó utilizando una combinación de microscopía de contraste de interferencia fluorescente y diferencial. Esta evaluación se realizó utilizando un software de imágenes para desarrollar vídeo de lapso de tiempo multipunto.

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.

Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

National Taiwan University Hospital.  This protocol describes a time-lapse live-cell imaging method to visualize antibody-dependent macrophage phagocytosis of green fluorescent protein–labeled triple-negative breast cancer cells using peripheral blood mononuclear cell–derived macrophages and an automated microscope.

Imágenes de lapso de tiempo de la fagocitosis de células de cáncer de mama triple negativo marcadas con proteína de fluorescencia verde por macrófagos mediada por anticuerpos

Explorar más videos