Software de Mapeo de Parámetros Microgliales (MMPS): Una herramienta de código abierto y fácil de usar para el análisis cuantitativo de la morfología de la microglía

El software de mapeo de parámetros microgliales, o MMPS, nos permite estudiar cómo la ferroptosis altera las subpoblaciones microgliales tras un ictus isquémico. MMPS aborda cuellos de botella clave dentro del campo del análisis microglial, evitando requisitos de software engorrosos y conocimientos de programación necesarios. Para empezar, abre el repositorio de GitHub en el ordenador y descarga el software de Mapeo de Parámetros Gliales o el paquete independiente MMPS.

En la carpeta de descargas, haz doble clic para iniciar la utilidad de archivo y extraer automáticamente la carpeta comprimida. Haz doble clic en el icono extraído de la aplicación MMPS para verificar y abrir el paquete MMPS. Haz clic en seleccionar la opción de carpeta de imágenes y navega por el directorio del ordenador para localizar los archivos del proyecto.

Concede permisos de acceso a carpetas y elige el directorio de almacenamiento de imágenes. A continuación, haz clic en seleccionar carpeta de salida y luego elige el directorio de salida. Selecciona la imagen a procesar y luego elige etiquetado de imagen.

Asigna identificadores de animales y grupos de tratamiento a la imagen y guarda las entradas. Para calcular el tamaño del píxel de la imagen, selecciona calibrar desde la barra de escala. Selecciona los puntos de inicio y final de la barra de escala, introduce la distancia conocida de la barra en micrómetros y haz clic en aplicar.

Selecciona el canal de fluorescencia que contiene la señal microglial. Selecciona las imágenes para su procesamiento marcando la casilla junto a cada nombre de imagen y procesalas individualmente si la fluorescencia de fondo difiere entre imágenes. Revisa las pestañas original, previa, procesado y máscaras para comparar las etapas de procesamiento de imagen.

Selecciona la vista previa de la imagen actual para ajustar ajustes adicionales de procesamiento. Para la resta de fondo, fija el valor de la bola rodante entre cinco y 150 píxeles. Para reducir los artefactos de iluminación, utiliza un valor de reducción de ruido de tres y establece los valores de nitidez entre uno y dos para mejorar la definición de los bordes.

Tras optimizar la configuración de procesamiento de imagen, haz clic en imágenes seleccionadas por proceso. Después, selecciona pick somas, todas las imágenes. Haz clic en mostrar color C para ver la vista compuesta RGB.

Selecciona canales y luego desmarca cualquier canal no utilizado si la imagen aparece distorsionada en color. Haz clic en ajustes de pantalla para ajustar el brillo del canal en la vista RGB. Selecciona microglía somas que muestren DAPI y molécula adaptadora de unión al calcio ionizada uno, o colocalización IBA1.

Elimina el soma incorrectamente seleccionado usando la tecla de retroceso o supr. Pulsa enter o regresar para pasar a la siguiente imagen. Selecciona el esquema de los somas una vez completada la selección de SOMA.

Describe el perímetro somático de cada célula microglólica seleccionada con al menos ocho puntos de contorno, excluyendo los procesos celulares. Elimina los puntos de contorno mal colocados usando deshacer el último punto, borrar o retroceder. Pulsa enter, retorno, doble clic o clic derecho para finalizar cada esquema de Soma.

Haz clic en generar todas las máscaras después de completar el esquema de Soma. En la configuración de generación de máscaras, ajusta la intensidad mínima para reducir los píxeles de fondo y equilibrar la supresión de fondo y la preservación de ramas. Selecciona QA de todas las mascarillas para comenzar el control de calidad de las mascarillas y revisa todas las mascarillas presentadas desde las áreas más grandes hasta las más pequeñas.

Compara cada máscara con la microglía correspondiente usando las pestañas procesadas y de máscara. Para aceptar máscaras, utiliza el acceso directo de teclado A. Para rechazar máscaras, usa el atajo de teclado R.

Para deshacer una aceptación o rechazo, pulsa B. Usa las flechas del teclado para navegar entre los tamaños de máscaras. Selecciona la máscara aceptable más grande que capture con precisión la ramificación microglial sin incluir células vecinas, fondos excesivos, bordes de imagen o barras de escala. Si la mayoría son inexactos, usa la opción de borrar todas las máscaras para regenerar las máscaras con un valor umbral diferente.

A continuación, selecciona calcular características simples para calcular varios parámetros de las máscaras aceptadas y luego haz clic en aceptar. Para análisis adicionales, descarga fractalanalysisimagej. Py, sholl.

py, y esqueletoanalisimagenj. Plugins PY. Para análisis fractales y de carcasa, abrir y ejecutar fractalanalysis imagej.

py como plugin de Fiji. Luego introduce la ubicación del directorio de salida. Introduce el tamaño del píxel y selecciona la opción de solo máscara más grande para analizar la mayor máscara aceptada por celda.

Para el análisis de sholl, open sholl. py como plugin de Fiji. Introduce la ubicación del directorio de salida, el tamaño deseado del píxel, el tamaño del paso.

Selecciona usar radio soma como radio inicial, o introduce un valor fijo de radio soma si no se usan radios soma derivados de MMPS. Imagen de esqueleto abierto. py como plugin de Fiji para análisis de esqueletos.

Navega e introduce las rutas para el directorio de máscaras, el directorio de salida y el tamaño del píxel cuando te lo pidan. Al terminar, exporta todos los resultados generados por el plugin como archivos de valores separados por comas a los directorios de salida específicos. El estudio de validación de MMPS utilizando un modelo de neuroinflamación en roedores inducido por lipopolisacáridos o LPS mostró que la administración de LPS disminuyó significativamente la distancia media del centroide y el perímetro celular en comparación con los controles tratados con vehículo.

No se observaron diferencias significativas en el área de la mascarilla, redondez o excentricidad entre los grupos de tratamiento. El área del soma aumentó significativamente en animales tratados con LPS en comparación con los controles de vehículo, consistente con la remodelación morfológica asociada a la activación de las células gliales. Más abajo, análisis morfológicos avanzados demostraron solo una débil correlación entre la redondez y el perímetro de la microglía en ratas tratadas con vehículo, y una fuerte correlación en ratas tratadas con LPS, lo que sugiere la asociación de un aumento de la activación microglial con una reducción de la redondez y el perímetro.

Además, el área de la máscara mostró fuertes correlaciones positivas con la distancia media del centroide tanto en grupos con vehículo como tratados con LPS, consistentes con cambios en la ramificación vinculados a la activación microglial. Este protocolo permite a los investigadores estudiar la intrincada ramificación microglial, la homogeneidad morfológica y la complejidad estructural. Obtener imágenes inmunofluorescentes de alta resolución es fundamental para utilizar con precisión MMPS.

Futuros estudios pueden utilizar MMPS para estudiar cómo los inhibidores ferroptóticos alteran la morfología microglial tras diferentes enfermedades del sistema nervioso, como el ictus.