Software de Mapeo de Parámetros Microgliales (MMPS): Una herramienta de código abierto y fácil de usar para el análisis cuantitativo de la morfología de la microglía

El software de mapeo de parámetros microgliales, o MMPS, nos permite estudiar cómo la ferroptosis altera las subpoblaciones microgliales después de un accidente cerebrovascular isquémico. MMPS aborda los principales cuellos de botella en el campo del análisis microglial, evitando requisitos de software engorrosos y conocimientos de codificación necesarios. Para comenzar, abra el repositorio de GitHub en la computadora y descargue el paquete independiente del software de mapeo de parámetros microgliales o MMPS.

En la carpeta de descargas, haga doble clic para abrir la utilidad de archivos comprimidos para extraer automáticamente la carpeta comprimida. Haga doble clic en el icono de la aplicación MMPS extraída para verificar y abrir el paquete MMPS. Haga clic en la opción de seleccionar la carpeta de imágenes y navegue por el directorio de la computadora para localizar los archivos del proyecto.

Otorgue permisos de acceso a la carpeta y elija el directorio de almacenamiento de imágenes. Luego, haga clic en seleccionar carpeta de salida y luego elija el directorio de salida. Seleccione la imagen para procesar y luego elija el etiquetado de la imagen.

Asigne identificadores de animales y grupos de tratamiento a la imagen y guarde las entradas. Para calcular el tamaño de píxel de la imagen, seleccione calibrar de la barra de escala. Seleccione los puntos de inicio y final de la barra de escala e ingrese la distancia conocida de la barra de escala en micrometros y haga clic en aplicar.

Seleccione el canal de fluorescencia que contiene la señal microglial. Seleccione imágenes para procesar marcando la casilla junto a cada nombre de imagen y proceselas individualmente si la fluorescencia de fondo difiere entre imágenes. Revise las pestañas original, vista previa, procesada y máscaras para comparar las etapas de procesamiento de imágenes.

Seleccione vista previa de imagen actual para ajustar configuraciones de procesamiento adicionales. Para la substracción de fondo, configure el valor de bola rodante entre cinco y 150 píxeles. Para reducir los artefactos de iluminación, use un valor de desnoise de tres y configure los valores de nitidez entre uno y dos para mejorar la definición de bordes.

Después de la optimización de la configuración de procesamiento de imágenes, haga clic en procesar imágenes seleccionadas. Luego, seleccione elegir somas, todas las imágenes. Haga clic en mostrar color C para ver la vista RGB compuesta.

Seleccione los canales, luego deseleccione los canales no utilizados si la imagen aparece distorsionada en color. Haga clic en ajustes de visualización para ajustar el brillo del canal en la vista RGB. Seleccione somas de microglia que muestren DAPI y molécula adaptadora de unión de calcio ionizado uno, o colocalización IBA1.

Elimine los somas seleccionados incorrectamente usando la tecla de retroceso o eliminar. Presione enter o return para pasar a la siguiente imagen. Seleccione somas de contorno todos después de que la selección de soma esté completa.

Delinee el perímetro del soma de cada célula microglial seleccionada con al menos ocho puntos de contorno, excluyendo los procesos celulares. Elimine los puntos de contorno colocados incorrectamente usando deshacer último punto, eliminar o retroceder. Presione enter, return, haga doble clic o haga clic derecho para finalizar cada contorno de soma.

Haga clic en generar todas las máscaras después de completar el delineado de soma. En la configuración de generación de máscaras, ajuste la intensidad mínima para reducir los píxeles de fondo y equilibrar la supresión del fondo y la preservación de ramas. Seleccione QA todas las máscaras para comenzar la garantía de calidad de máscaras y revise todas las máscaras presentadas de las áreas más grandes a las más pequeñas.

Compare cada máscara con la microglia correspondiente usando las pestañas procesada y máscara. Para aceptar máscaras, use el atajo de teclado A. Para rechazar máscaras, use el atajo de teclado R.

Para deshacer una aceptación o rechazo, presione B. Use las teclas de flecha del teclado para navegar por los tamaños de máscara. Seleccione la máscara aceptable más grande que capture con precisión la ramificación microglial sin incluir células vecinas, exceso de fondo, bordes de imagen o barras de escala. Si la mayoría son inexactas, use la opción de borrar todas las máscaras para regenerar las máscaras con un valor de umbral diferente.

Luego, seleccione calcular características simples para calcular varios parámetros para máscaras aceptadas, luego haga clic en aceptar. Para análisis adicionales, descargue fractalanalysisimagej. py, sholl.

py, y los plugins skeletonanalysisimagej. py. Para análisis fractal y de casco, abra y ejecute fractalanalysisimagej.

py como un complemento de Fiji. Luego ingrese la ubicación de la carpeta de salida. Ingrese el tamaño de píxel y seleccione la opción de máscara más grande solo para analizar la máscara más grande aceptada por celda.

Para el análisis sholl, abra sholl. py como un complemento de Fiji. Ingrese la ubicación de la carpeta de salida, el tamaño de píxel deseado, el tamaño del paso.

Seleccione usar el radio del soma como radio de inicio o ingrese un valor de radio fijo del soma si no se usan los radios del soma derivados de MMPS. Abra skeletonanalysisimagej. py como un complemento de Fiji para el análisis de esqueleto.

Navegue e ingrese las rutas para la carpeta de máscaras, la carpeta de salida y el tamaño de píxel cuando se le solicite. Al finalizar, exporte todos los resultados generados por el complemento como archivos de valores separados por comas en las carpetas de salida específicas. El estudio de validación de MMPS utilizando un modelo de neuroinflamación en roedores inducido por lipopolisacárido o LPS mostró que la administración de LPS disminuyó significativamente la distancia promedio del centroide y el perímetro celular en comparación con los controles tratados con vehículo.

No se observaron diferencias significativas en el área de la máscara, redondeo o excentricidad entre los grupos de tratamiento. El área del soma fue significativamente mayor en los animales tratados con LPS en comparación con los controles con vehículo, lo que es consistente con el remodelado morfológico asociado a la activación de las células gliales. Además, los análisis morfológicos avanzados demostraron solo una débil correlación entre el redondeo y el perímetro de las microglias en las ratas tratadas con vehículo, y una fuerte correlación en las ratas tratadas con LPS, lo que sugiere la asociación de una mayor activación de las microglias con una reducción del redondeo y el perímetro.

Además, el área de la máscara demostró fuertes correlaciones positivas con la distancia promedio del centroide en ambos grupos tratados con vehículo y LPS, lo que es consistente con los cambios en la ramificación vinculados a la activación de las microglias. Este protocolo permite a los investigadores estudiar la ramificación microglial intrincada, la homogeneidad morfológica y la complejidad estructural. Obtener imágenes inmunofluorescentes de alta resolución es fundamental para usar MMPS con precisión.

Los estudios futuros pueden utilizar MMPS para estudiar cómo los inhibidores de la ferroptosis alteran la morfología de las microglias después de diferentes enfermedades del sistema nervioso, como el accidente cerebrovascular.