Name: Ensayos de cocultivo sin contacto para estudios morfométricos durante las interacciones entre especies en hongos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprenda ensayos de cocultivo sin contacto para estudiar interacciones microbianas y cambios morfológicos en hongos. Estos métodos accesibles permiten analizar factores interespecíficos mediante técnicas de membrana y sobrenadantes libres de células.

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Este trabajo fue apoyado por la Beca Intermedia DBT-Wellcome Trust India Alliance (IA/I/19/1/504294) otorgada a RNP. KBSS recibió apoyo del Subsidio Especial de Investigación de la Universidad de Ahmedabad (AU/SRG/SAS/20-21/07_KS_03.25) y del Subsidio de Investigación Fundamental del SERB (URBSASE23A6/SERB/23-24/KS_02.27). Los iconos utilizados en la Figura 1 se adaptaron de Servier Medical Art (https://smart.servier.com/), bajo licencia CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), y de BioArt Source, NIAID, NIH.

<ol>
	<li>Peleg AY, Hogan DA, Mylonakis E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat Rev Microbiol. 2010;8(5):340-349.</li>
	<li>Waters CM, Bassler BL. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol. 2005;21:319-346.</li>
	<li>Foster KR, Bell T. Competition, not cooperation, dominates interactions among culturable microbial species. Curr Biol. 2012;22(19):1845-1850.</li>
	<li>Carolus H, Van Dyck K, Van Dijck P. Candida albicans and Staphylococcus species: a threatening twosome. Front Microbiol. 2019;10:2162.</li>
	<li>Pasman R, et al. Candida albicans and Staphylococcus aureus reciprocally promote their virulence factor secretion and pro-inflammatory effects. Front Cell Infect Microbiol. 2025;15:1629373.</li>
	<li>Grandcl&#233;ment C, Tanni&#232;res M, Mor&#233;ra S, Dessaux Y, Faure D. Quorum quenching: role in nature and applied developments. FEMS Microbiol Rev. 2016;40(1):86-116.</li>
	<li>Goers L, Freemont P, Polizzi KM. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J R Soc Interface. 2014;11(96):20140065.</li>
	<li>Burmeister A, Gr&#252;nberger A. Microfluidic cultivation and analysis tools for interaction studies of microbial co-cultures. Curr Opin Biotechnol. 2020;62:106-115.</li>
	<li>Kapoore RV, Padmaperuma G, Maneein S, Vaidyanathan S. Co-culturing microbial consortia: approaches for applications in biomanufacturing and bioprocessing. Crit Rev Biotechnol. 2022;42(1):46-72.</li>
	<li>Kalluri R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 2016;16(9):582-598.</li>
	<li>Deveau A, et al. Bacterial-fungal interactions: ecology, mechanisms and challenges. FEMS Microbiol Rev. 2018;42(3):335-352.</li>
	<li>Temkin MI, Carlson CM, Stubbendieck AL, Currie CR, Stubbendieck RM. High throughput co-culture assays for the investigation of microbial interactions. J Vis Exp. 2019;(152). doi:10.3791/60275.</li>
	<li>Cecchelli R, et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 2014;9(6):e99733.</li>
	<li>Wodzanowski KA, Cassel SE, Grimes CL, Kloxin AM. Tools for probing host-bacteria interactions in the gut microenvironment: from molecular to cellular levels. Bioorg Med Chem Lett. 2020;30(10):127116.</li>
	<li>Luo Y, McAuley DF, Fulton CR, Pessoa JS, McMullan R, Lundy FT. Targeting Candida albicans in dual-species biofilms with antifungal treatment reduces Staphylococcus aureus and MRSA in vitro. PLoS One. 2021;16(4):e0249547.</li>
	<li>Justus CR, Marie MA, Sanderlin EJ, Yang LV. Transwell in vitro cell migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 2023;2644:349-359.</li>
	<li>McCarty NS, Ledesma-Amaro R. Synthetic biology tools to engineer microbial communities for biotechnology. Trends Biotechnol. 2019;37(2):181-197.</li>
	<li>Virgo M, Mostowy S, Ho BT. Emerging models to study competitive interactions within bacterial communities. Trends Microbiol. 2025;33(6):688-700.</li>
	<li>Moutinho TJ, Panagides JC, Biggs MB, Medlock GL, Kolling GL, Papin JA. Novel co-culture plate enables growth dynamic-based assessment of contact-independent microbial interactions. PLoS One. 2017;12(8):e0182163.</li>
	<li>Gnecchi M, Zhang Z, Ni A, Dzau VJ. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 2008;103(11):1204-1219.</li>
	<li>Hogan DA, Vik &#197;, Kolter R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 2004;54(5):1212-1223.</li>
	<li>Poon Y, Hui M. Inhibitory effect of lactobacilli supernatants on biofilm and filamentation of Candida albicans, Candida tropicalis, and Candida parapsilosis. Front Microbiol. 2023;14. doi:10.3389/fmicb.2023.1105949.</li>
	<li>Huh D, Matthews BD, Mammoto A, Montoya-Zavala M, Hsin HY, Ingber DE. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 2010;328(5986):1662-1668.</li>
	<li>Huh D, et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 2013;8(11):2135-2157.</li>
	<li>Bhatia SN, Ingber DE. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 2014;32(8):760-772.</li>
	<li>Itani A, Shida Y, Ogasawara W. A microfluidic device for simultaneous detection of enzyme secretion and elongation of a single hypha. Front Microbiol. 2023;14:1125760.</li>
	<li>Beneyton T, Thomas S, Griffiths AD, Nicaud JM, Drevelle A, Rossignol T. Droplet-based microfluidic high-throughput screening of heterologous enzymes secreted by the yeast Yarrowia lipolytica. Microb Cell Fact. 2017;16:18.</li>
	<li>Xu XL, et al. Bacterial peptidoglycan triggers Candida albicans hyphal growth by directly activating the adenylyl cyclase Cyr1p. Cell Host Microbe. 2008;4(1):28-39.</li>
	<li>Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) medium (liquid or solid). Cold Spring Harb Protoc. 2017;2017(8):pdb.rec090563.</li>
	<li>Parnandi VA, Trivedi PM, Panchal H, Suryawanshi G, Patkar RN. A small Candida glabrata protein promotes hyphal growth in C. albicans during mixed-species invasive candidiasis. Curr Biol. 2026;36(1):1-15.e9.</li>
	<li>Davis-Hanna A, Piispanen AE, Stateva LI, Hogan DA. Farnesol and dodecanol effects on the Candida albicans Ras1-cAMP signalling pathway and the regulation of morphogenesis. Mol Microbiol. 2008;67(1):47-62.</li>
	<li>Polke M, et al. A functional link between hyphal maintenance and quorum sensing in Candida albicans. Mol Microbiol. 2017;103(4):595-617.</li>
	<li>Su C, Yu J, Sun Q, Liu Q, Lu Y. Hyphal induction under the condition without inoculation in Candida albicans is triggered by Brg1-mediated removal of NRG1 inhibition. Mol Microbiol. 2018;108(4):410-423.</li>
	<li>Senesi N, Wilkinson KJ. Biophysical Chemistry of Fractal Structures and Processes in Environmental Systems. Chichester: John Wiley &#38; Sons; 2008: ISBN: 978-0-470-01474-5.</li>
	<li>Bayry J, Aimanianda V, Guijarro JI, Sunde M, Latg&#233; JP. Hydrophobins&#8212;unique fungal proteins. PLoS Pathog. 2012;8(5):e1002700.</li>
	<li>Ojkic N, Serbanescu D, Banerjee S. Surface-to-volume scaling and aspect ratio preservation in rod-shaped bacteria. eLife. 2019;8:e47033.</li>
	<li>Li X, de Souza RA, Heinemann M. The rate of glucose metabolism sets the cell morphology across yeast strains and species. Curr Biol. 2025;35(4):788-798.e4.</li>
	<li>Mochizuki S, Minami E, Nishizawa Y. Live-cell imaging of rice cytological changes reveals the importance of host vacuole maintenance for biotrophic invasion by blast fungus, Magnaporthe oryzae. MicrobiologyOpen. 2015;4(6):952-966.</li>
	<li>Fernandez J, Orth K. Rise of a cereal killer: the biology of Magnaporthe oryzae biotrophic growth. Trends Microbiol. 2018;26(7):582-597.</li>
	<li>Wengler MR, Talbot NJ. Mechanisms of regulated cell death during plant infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Cell Death Differ. 2025;32(5):793-801.</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses competidores ni conflictivos.

Un informe previo, que utilizó una placa de pozo con inserto de membrana y un ensayo basado en CFS, mostró que C. albicans desarrolla hifas en respuesta a células de C. glabrata o su CFS. Sin embargo, esta respuesta no fue inducida por otras levaduras, como Saccharomyces cerevisiae y Candida dubliniensis30. Además, esta respuesta hifal no se limitó únicamente a la cepa de referencia de laboratorio C. albicans SC5314, sino que también ocurrió en otros contextos genómicos, incluido el aislado clínico WUM5A30. En este protocolo, se estableció un flujo de trabajo estandarizado basado en estos hallazgos para cuantificar tres métricas morfológicas: longitud hifal, volumen hifal y grosor hifal. Asimismo, estos factores morfológicos se utilizaron para evaluar cómo las variaciones en la ploidía y el estado del locus del tipo de apareamiento afectan las características morfológicas de C. albicans en respuesta a una molécula inductora secretada.
Las metodologías sin contacto descritas aquí proporcionan un marco experimental sencillo para visualizar y analizar los resultados morfométricos de las señales solubles entre especies. Mientras que la placa de pocillos con inserto de membrana permite la difusión bidireccional entre cultivos activos, el ensayo basado en SFC ofrece un formato escalable porque los componentes inductores necesarios se obtienen independientemente del cultivo diana posterior. Es necesario mantener una proporción de aproximadamente 1:50 (C. albicans a C. glabrata) en el montaje de la placa de pocillos con inserto de membrana para garantizar la consistencia del ensayo. Este gradiente de concentración asegura un flujo adecuado de las moléculas inductoras solubles a través de la barrera de membrana, al tiempo que se mantiene por debajo de los umbrales de acumulación de inhibidores endógenos de la detección de cuórum, como el farnesol, que puede suprimir la cinética de filamentación de C. albicans31,32. De manera similar, un paso crítico en el ensayo basado en SFC es el período de incubación de 18 h necesario para que el cultivo fuente de C. glabrata alcance uniformemente la fase estacionaria tardía de crecimiento. Si el período de incubación del cultivo de C. glabrata es inferior a 12 h o superior a 24 h, es menos probable que el SFC recolectado tenga una concentración óptima de la molécula inductora específica estudiada aquí, lo que conduce a una inducción subóptima de hifas. El estadio de crecimiento adecuado para recolectar el SFC o la proporción de cultivos debe estandarizarse para cualquier nuevo objetivo experimental y/o nuevas combinaciones de especies microbianas.
Para maximizar la reproducibilidad del ensayo en diferentes entornos de laboratorio, se recomiendan las siguientes mejoras procedimentales clave. Se recomienda el uso de medio mínimo con glucosa (GMM) para el cultivo nocturno de todas las cepas diploides de C. albicans. El uso de GMM suprime la autofilamentación de fondo frecuentemente observada en el medio rico en nutrientes YPD. Dicha autofilamentación también se ha observado en otros estudios, aunque el mecanismo subyacente aún no está claro33. Asimismo, se recomienda la eliminación física completa del inserto de membrana de policarbonato antes de la adquisición de imágenes, para eliminar la dispersión de la luz y las aberraciones ópticas que podrían interferir durante la microscopía de campo claro con alto aumento.
Si bien estas configuraciones sin contacto ayudan a separar los roles de los componentes solubles de la señalización, presentan desafíos experimentales específicos. Por ejemplo, los ensayos sin contacto son propensos a riesgos menores, como la ruptura de la membrana debido a un manejo inadecuado y, por lo tanto, al cruce microbiano. Por ello, se debe prestar atención al colocar las puntas de pipeta, teniendo cuidado de que las puntas toquen las paredes de la cámara de los insertos y no la membrana durante el muestreo. Además, puede ocurrir contaminación cruzada física entre compartimentos debido a tamaños de poro incorrectos (más grandes), lo cual puede resolverse fácilmente utilizando insertos con un tamaño de poro de membrana adecuado. El crecimiento excesivo de hongos o la deposición extensa de biopelículas puede cubrir la membrana porosa. Esto se evita limitando las inóculaciones iniciales a una DO600 = 0,1 y no incubando más allá de 12 h. Asimismo, los microorganismos pueden no distribuirse homogéneamente dentro de los pocillos del dispositivo, a menudo agrupándose o adherirse cerca de la membrana, lo que puede provocar sesgos inesperados en las mediciones de densidad óptica. Además, dado que estos sistemas separan físicamente las dos poblaciones, no pueden replicar ni evaluar interacciones que dependan del contacto físico directo entre células. Por ejemplo, la maduración de biopelículas de especies mixtas, la coagregación mecánica o la señalización mediada por adhesinas de la pared celular ancladas en la superficie. Aunque estos ensayos basados en placas proporcionan una instantánea efectiva del punto final de la cinética temprana de filamentación (a las 3 h), no capturan la dinámica de crecimiento a largo plazo ni el comportamiento espacial. Para investigadores que requieran un seguimiento continuo en tiempo real durante períodos prolongados, los canales de perfusión microfluídicos especializados o las cámaras de imagen automatizadas para células vivas pueden ofrecer una alternativa más adecuada.
La geometría celular está fundamentalmente relacionada con la eficiencia metabólica, siendo la relación entre área de superficie y volumen (SA/V) un factor clave para la adquisición de nutrientes y el transporte intracelular. En los hongos dimórficos y filamentosos, la transición hacia un morfotipo hifal alargado funciona como una adaptación estructural para mantener una relación SA/V optimizada. Esto permite una absorción distribuida de nutrientes a lo largo de la pared del filamento alargado, al tiempo que se sostienen los procesos metabólicos dirigidos al ápice hifal34,35,36,37. Sin embargo, nuestro estudio muestra que la escala morfométrica no es uniformemente proporcional en diferentes estados de ploidía y configuraciones del locus del tipo de apareamiento.
Los conjuntos de datos morfométricos generados mediante este protocolo de seguimiento revelan tendencias claras de escala estructural correlacionadas con la ploidía, ya que las líneas haploides exhiben consistentemente valores absolutos menores en todas las métricas geométricas en comparación con las cepas diploides correspondientes (Figura 5). Dentro del fondo diploide, la configuración homocigótica MATα/α mostró una cinética de filamentación mejorada (longitud y volumen) en comparación con las cepas MATa/a o MATa/α bajo estas condiciones in vitro. Dado que una mayor filamentación se asocia frecuentemente con una capacidad de penetración incrementada, no está claro por qué los aislados clínicos de C. albicans se obtienen predominantemente como diploides heterocigotos (MATa/α). Es posible que, dentro de un huésped inmunocompetente, el estado heterocigoto proporcione una ventaja de aptitud más amplia para la colonización comensal a largo plazo. En otras palabras, las características estructurales del morfotipo MATa/α están optimizadas para la supervivencia frente a la vigilancia inmunitaria del huésped. Por lo tanto, futuras investigaciones deberían aprovechar estos sistemas estandarizados de cultivo conjunto para evaluar sistemáticamente la aptitud comparativa de diferentes homocigotos de tipo de apareamiento bajo distintas presiones selectivas.
Estudios previos han documentado que la morfología vacuolar, la dinámica de fisión y fusión, y la expansión estructural desempeñan funciones importantes en la regulación del volumen interno y de la presión de turgencia en los filamentos fúngicos en alargamiento. Por ejemplo, en el patógeno del tizón del arroz Magnaporthe oryzae, las transiciones distintas entre hifas vegetativas delgadas y estructuras invasivas bulbosas están estrechamente coordinadas con cambios en la organización vacuolar38,39,40. Sin embargo, el presente protocolo no monitoreó directamente la dinámica vacuolar durante la filamentación de C. albicans; rastrear estos cambios en los orgánulos internos en relación con el volumen estructural total representa una vía informativa para investigaciones futuras. Además, se requiere más investigación para determinar por qué ciertos componentes específicos del secretoma de origen fúngico inducen cinéticas diferentes de escalamiento morfológico en comparación con los inductores químicos de origen hospedador, como el suero.
Los métodos de co-cultivo sin contacto detallados en este protocolo pueden adaptarse para investigar interacciones entre especies y entre reinos, como la dinámica de señalización entre poblaciones bacterianas oportunistas y hongos dimórficos. Además, debido a que estos formatos de 96 y 24 pocillos son escalables, esta plataforma cuantitativa puede utilizarse para cribados químicos. Ejemplos de ello incluyen la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas o compuestos antifúngicos novedosos que interrumpan selectivamente las vías de filamentación estimuladas por el secretoma, sin afectar directamente la viabilidad celular basal.

En ecosistemas naturales y clínicos, los microorganismos suelen residir dentro de comunidades polimicrobianas estructuradas, gobernadas por redes complejas de interacciones intra- y&#160;interespecífico&#160;comunicación1. Estos consorcios utilizan diversas señales químicas, incluyendo moléculas de quorum-sensing, compuestos orgánicos volátiles y péptidos y proteínas secretorios, para coordinar comportamientos a nivel de población2. Mapear estas dinámicas de comunicación es fundamental, ya que las interacciones en el nicho de tipo cooperativo, competitivo o depredador alteran significativamente el metabolismo microbiano, la arquitectura espacial y la adaptación al estrés3Clínicamente, estas redes polimicrobianas (como consorcios bacteriano-fúngicos de doble especie o fúngico-fúngicos entre especies) frecuentemente presentan virulencia sinérgica, colonización acelerada de los tejidos y resistencia antimicrobiana elevada, en comparación con cultivos monoclonales.4,5. Por lo tanto, descifrar los determinantes moleculares de las comunicaciones microbianas es fundamental para superar los modelos tradicionales y desarrollar estrategias antiinfecciosas innovadoras que interrumpan la estabilidad de las comunidades6.
Para diseccionar modos específicos de comunicación microbiana, los investigadores utilizan diversas configuraciones experimentales, empleadas principalmente en biología celular de mamíferos, inmunología y oncología7,8,9. Por ejemplo, los modelos de co-cultivo con contacto directo sirven como estándar para investigar la señalización&#160;juxtacrina&#160; y las interacciones físicas célula a célula10. Configuraciones similares, con modificaciones, también se utilizan para estudiar interacciones físicas entre microorganismos, comprendiendo la inhibición cruzada microbiana o la respuesta a fármacos9,11,12. Sin embargo, es difícil distinguir los mecanismos subyacentes, ya que tanto las señales dependientes del contacto como las difusibles contribuyen a la respuesta observada. Aunque los ensayos tradicionales basados en contacto pueden ofrecer información espacial, son laboriosos y/o requieren etiquetado específico de cepas, lo cual puede resultar tedioso en organismos no modelo. Por el contrario, los ensayos con Transwell (placas de pozo con insertos de membrana) se utilizan, principalmente en estudios con mamíferos, para diferenciar las contribuciones de las señales dependientes del contacto y las difusibles13,14,15,16. Este método es particularmente útil cuando la comunicación celular está mediada por moléculas secretadas, permitiendo el análisis en tiempo real de la dinámica de señalización entre poblaciones celulares17. Además, los ensayos sin contacto ofrecen la ventaja de una separación mediante membrana que también puede integrarse con modelos computacionales para rastrear dinámicamente microorganismos que los métodos tradicionales pasan por alto18. Este enfoque se utiliza ocasionalmente para estudiar simultáneamente la cinética del desarrollo de diferentes especies bacterianas19.
Una alternativa más económica y de alto rendimiento al ensayo con placas de pocillos con insertos de membrana es el ensayo basado en sobrenadante libre de células (CFS) o en medio condicionado. Se sabe que este ensayo se utiliza en medicina regenerativa y biología vascular para aislar secretomas necesarios para comprender la reparación tisular mediada por células madre y/o la angiogénesis inducida por tumores20. De manera similar, en estudios microbianos, los marcos basados en CFS han sido útiles para descifrar la competencia polimicrobiana. Por ejemplo, se han utilizado filtrados bacterianos (como&#160;Pseudomonas aeruginosa&#160;acetil-homoserina lactonas o&#160;Lactobacillus&#160;metabolitos) para modular la maduración del biofilm fúngico21,22.&#160;Más recientemente, las plataformas microfluídicas han permitido una biomímica fisiológica de alta fidelidad mediante tecnologías de órganos-en-un-chip23,24. Aunque los sistemas microfluídicos se han implementado para la detección simultánea de la respuesta de la comunidad microbiana frente a sus secretomas, requieren instrumentación y experiencia especializadas y pueden no implementarse fácilmente en todos los entornos25,26,27. Por lo tanto, los ensayos con placas de pocillos con insertos de membrana y los basados en CFS prometen ser los métodos de elección en la mayoría de los casos. La elección entre estos dos ensayos dependerá de la naturaleza de la molécula secretora. Si la molécula secretora es inestable, es decir, tiene una vida media corta, y requiere medir actividad en tiempo real, el ensayo con placa de pocillos con inserto de membrana es más adecuado. Por el contrario, si la molécula secretora es estable y el experimento es a gran escala, un ensayo basado en CFS sería más económico.
El objetivo principal de este protocolo es presentar una metodología cualitativa y cuantitativa paso a paso para el seguimiento de características morfológicas, utilizando placas de pozo con insertos de membrana y plataformas CFS (Figura 1). Aquí, se ha demostrado con la comunicación inducida por factores secretados entre Candida albicans y Candida glabrata como ejemplo. Además, estas herramientas también pueden cuantificar los efectos de variables genéticas intrínsecas (ploidía y estado del locus de apareamiento) en la alteración del desarrollo geométrico absoluto (longitud, volumen y diámetro) de los filamentos de&#160;C. albicans&#160;, cuando están expuestos a moléculas señalizadoras secretoras. Este protocolo establecido proporciona una plataforma sencilla, asequible y sin contacto, adecuada para estudiar la dinámica de señalización entre especies.

<table><tbody><tr><td>Filtro de jeringa de PES de 0,22 &amp;mu;m</td><td>Millipore (Merck)</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>HiMedia</td><td>GRM666</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>HiMedia</td><td>GRM016</td><td></td></tr><tr><td>Placa portadora Nunc de 24 pocillos con insertos para cultivo celular (0,4 &amp;mu;m)</td><td>Thermo Scientific</td><td>141002</td><td></td></tr><tr><td>Nunc BioLite Multicaja de 96 pocillos, tratada para cultivo celular, fondo plano</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Proteosa peptona</td><td>HiMedia</td><td>RM005</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma</td><td>U6381</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>HiMedia</td><td>RM027</td><td></td></tr><tr><td>Base de nitrógeno para levadura, con sulfato de amonio, sin aminoácidos</td><td>HiMedia</td><td>M878</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayos de cocultivo sin contacto para estudios morfométricos durante las interacciones entre especies en hongos

Contactless Co-Culture Assays for Morphometric Studies During Inter-Species Interactions in Fungi

El comportamiento y la morfología celulares suelen estar influenciados por diversos factores intra y extracelulares en una comunidad microbiana. Los diferentes enfoques disponibles para estudiar la comunicación microbiana pueden ser tediosos y/o requerir instalaciones y conocimientos especializados.&#160;Aquí se describen dos enfoques complementarios de co-cultivo sin contacto: el ensayo de co-cultivo en placas de pozo con insertos de membrana y el ensayo basado en el sobrenadante libre de células (CFS), que se fundamentan en la transición morfológica como respuesta medible para investigar el papel de diversos factores en una interacción inter-específica determinada. El sistema de placa de pozo con inserto de membrana, aunque permite la difusión de moléculas extracelulares, posibilita la interacción en tiempo real entre especies físicamente separadas. En comparación, el ensayo basado en CFS ofrece un enfoque simplificado y escalable para evaluar las respuestas a medios acondicionados. El protocolo presentado aquí incluye procedimientos estandarizados para la preparación de cultivos, la generación de sobrenadantes acondicionados, el montaje del ensayo, microscopía, adquisición de imágenes, análisis morfométrico cuantitativo mediante Fiji y evaluación estadística. Esto se ha demostrado con un ejemplo de la respuesta morfológica fúngica a factores intrínsecos y extrínsecos. Los métodos aquí presentados ofrecen herramientas alternativas accesibles y adaptables para estudiar nuevas interacciones microbianas en una comunidad, y podrían extenderse fácilmente para investigar los mecanismos subyacentes a la coexistencia de múltiples especies en una comunidad.

Ensayos de co-cultivo sin contacto para explorar interacciones entre especies
Las moléculas señalizadoras extracelulares solubles y de baja abundancia suelen mediar eventos clave de comunicación durante la convivencia microbiana mixta. Se evaluaron tales dinámicas mediante dos configuraciones celulares sin contacto, diseñadas para analizar los patrones de interacción entre C. albicans y C. glabrata, al tiempo que se evitaba el contacto físico directo entre células. La primera configuración utilizó un sistema de cultivo en placas de pozo con insertos de membrana integrados, en el que las dos poblaciones estaban físicamente separadas por una membrana de policarbonato inerte y porosa de 0,4 µm, lo que permitía la difusión bidireccional sin obstáculos de las moléculas secretadas a través de la barrera. La segunda configuración monitoreó el crecimiento de células de levadura de C. albicans cultivadas directamente en placas de microtitulación que contenían sobrenadante libre de células obtenido de cultivos de C. glabrata en fase estacionaria (CgCFS).
Consistente con las pantallas previas30, las células diploides heterocigotas de tipo salvaje de C. albicans (SC5314) desarrollaron fácilmente hifas verdaderas en respuesta a células de C. glabrata separadas por la barrera del inserto de membrana o al CgCFS filtrado. Por el contrario, las células mantenidas en medio de control negativo puro (GMM o YPD) permanecieron predominantemente en forma de levadura gemante y pseudohifal (Figura 2A). Los análisis comparativos demostraron consistencia entre las dos configuraciones del ensayo. Ambos ensayos arrojaron valores comparables en todas las métricas estructurales, incluyendo longitud, volumen y grosor del filamento (Figura 2). Se consideró que la diferencia en los parámetros morfológicos era significativa si el valor de p obtenido de las pruebas estadísticas apropiadas, seguidas por pruebas post hoc para comparaciones múltiples, cumplía con el criterio de 0,05. Estas observaciones mostraron que las células de C. albicans no presentaron una diferencia significativa en la longitud de las hifas verdaderas inducidas por células de C. glabrata en el sistema de placa de pozo con inserto de membrana (39,66 µm ± 6,81 µm) o cuando fueron expuestas al CgCFS filtrado (37,13 µm ± 6,50 µm; Figura 2B). De manera similar, los volúmenes de estos filamentos inducidos en el sistema de placa de pozo con inserto de membrana (112,10 µm3 ± 22,59 µm3) tampoco fueron significativamente diferentes de los observados en el medio acondicionado con CgCFS (109,78 µm3 ± 34,69 µm3; Figura 2C). Además, las mediciones del diámetro del filamento confirmaron que el grosor promedio de las hifas se mantuvo constante entre las dos configuraciones, con valores de 1,89 ± 0,10 µm para la configuración de placa de pozo con inserto de membrana y de 1,92 µm ± 0,23 µm para el tratamiento con CgCFS (Figura 2D).
Los estados de ploidía y las configuraciones del tipo de apareamiento alteran las dimensiones morfológicas in vitro
Se han establecido los roles de los niveles de ploidía y las arquitecturas del locus de apareamiento en la regulación de las transiciones dimórficas en distintos sistemas modelo de hongos. Aquí, se aplicó una tubería analítica de seguimiento para cuantificar métricas de filamentación, específicamente la longitud de los hifas, el volumen estructural, el grosor y el volumen correspondiente de la célula madre en levadura, en un conjunto de cepas haploides (MATa o MATα) y diploides (MATa/a, MATα/α o MATa/α) de C. albicans.
El perfilado estructural reveló que tras la exposición al secretoma inductor de CgCFS o al control positivo de suero, la cepa diploide homocigota alfa (MATα/α) formó filamentos con ejes significativamente más largos (45,56 µm ± 9,24 µm y 46,62 µm ± 9,07 µm) y mayor volumen (125,24 µm3 ± 39,94 µm3 y 119,45 µm3 ± 37,32 µm3), en comparación con la cepa diploide homocigota MATa/a (Figura 3A,C). Aunque los aislados clínicos estándar de C. albicans existen predominantemente como diploides heterocigotos, la cepa de referencia MATa/α exhibió filamentos más largos y volúmenes mayores en relación con la cepa MATa/a tras la inducción (especialmente con suero). Sin embargo, estos valores fueron significativamente menores que los de la cepa homocigota MATα/α (Figura 3B,D).
Al mismo tiempo, las cepas haploides mostraron un patrón inverso, en el que la cepa haploide MATa presentó un aumento significativo en la longitud de hifas en comparación con la cepa haploide MATα bajo ambas condiciones de inducción (CgCFS: 22,06 µm ± 5,41 µm frente a 17,58 µm ± 4,12 µm; Suero: 23,71 µm ± 6,59 µm frente a 21,00 µm ± 5,29 µm; Figura 4A). Curiosamente, este aumento en longitud dentro del fondo haploide se tradujo en un incremento del volumen de hifas (38,84 µm3 ± 19,58 µm3 frente a 34,25 µm3 ± 19,62 µm3) únicamente en respuesta al CgCFS (Figura 4B). Estas mediciones iniciales in vitro sugieren una interacción compleja entre los estados de ploidía y las configuraciones del locus del tipo de apareamiento, lo que indica que los loci MATa y MATα probablemente contribuyen de manera diferente a la dinámica de filamentación.
Para estudiar las relaciones estadísticas entre estas métricas estructurales en los conjuntos de datos combinados, se realizaron análisis de correlación por rangos de Spearman (ρ) y regresión lineal de Pearson (R2), que incluyeron todas las variantes de ploidía y tipo de apareamiento evaluadas. Se observaron correlaciones positivas en todos los pares analizados: longitud del hifa frente a volumen del hifa, longitud del hifa frente a grosor del hifa, longitud del hifa frente a volumen de la célula madre y volumen total del hifa frente a volumen de la célula madre en forma de levadura (Figura 5, Tabla suplementaria 1 y Tabla suplementaria 2).
La relación más fuerte se observó entre la longitud del hifa y el volumen fúngico calculado (ρ = 0.91; Figura 5A). Por el contrario, la correlación más débil fue entre el volumen inicial de la célula madre de levadura y el volumen del hifa emergente (ρ = 0.63; Figura 5C). Además, el grosor del hifa no se correlacionó tan fuertemente con la longitud del hifa como lo hizo el volumen del hifa (Figura 5A,D). El volumen de la célula madre, la longitud del hifa y el grosor del hifa no presentaron diferencias estadísticamente significativas en sus correlaciones (Figura 5B,D). Estas distribuciones geométricas sugieren que un volumen inicial mayor de la célula madre de levadura no necesariamente da lugar a hifas más largas o a un volumen mayor.
En resumen, estos resultados demuestran la utilidad de la placa de pocillos con insertos de membrana y de los ensayos basados en CFS para visualizar y cuantificar variaciones morfogenéticas en C. albicans sin ningún contacto físico. Los datos generados mediante este protocolo revelan diferentes características morfológicas en cepas con distintos fondos de ploidía y configuraciones de tipo de apareamiento. Estos ensayos sin contacto ofrecen una metodología flexible y escalable que puede adaptarse para investigar la dinámica de señalización interespecífica en diversas combinaciones microbianas.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig1.jpg" /> 
Figura 1: Una representación esquemática de los ensayos de co-cultivo en placas de pozo con insertos de membrana y de inducción de hifas basados en CFS con especies de Candida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig2.jpg" /> 
Figura 2: Comparación de las morfologías de hifas observadas entre la placa de pocillos con inserto de membrana y los ensayos sin contacto basados en CFS. (A) Micrografías representativas de campo brillante que muestran la respuesta morfológica de C. albicans frente a YPD (control), C. glabrata en un montaje de placa de pocillos con inserto de membrana, o al medio acondicionado con el sobrenadante libre de células de C. glabrata (CFS). Las flechas rosadas, negras y blancas indican levadura, pseudohifas e hifas verdaderas, respectivamente. Barra de escala, 10 µm. Longitudes de las hifas (B), volúmenes de las hifas (C) y grosor de las hifas (D) de una cepa diploide heterocigótica de C. albicans (SC5314) observadas en respuesta a células de C. glabrata en un montaje de placa de pocillos con inserto de membrana o al CFS de C. glabrata. Los datos representan la mediana ± intervalos de confianza del 95 %, provenientes de tres experimentos biológicos independientes, con n = 50 células. ns, no significativo: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig3.jpg" /> 
Figura 3: El tipo de apareamiento y la zigocidad tienen efectos significativos en la morfología de hifas en C. albicans diploide. Gráficos que muestran longitudes comparativas de hifas, en respuesta a la molécula inductora indicada, entre diploides homocigotos (A) y entre diploides heterocigotos y homocigotos (B) de C. albicans. De manera similar, se muestran los volúmenes comparativos de hifas, en respuesta a las moléculas inductoras mencionadas, entre diploides homocigotos (C) y entre diploides heterocigotos y homocigotos (D). Control: YPD, medio de control que no induce la formación de hifas. Los datos representan la mediana ± intervalos de confianza del 95%, provenientes de tres experimentos biológicos independientes, con n = 50 células. Los números indicados en la parte superior del gráfico corresponden a valores de p, determinados mediante comparaciones con la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. **: p &#60; 0,01, ***: p &#60; 0,001, ****: p &#60; 0,0001, estadísticamente significativo; ns, no significativo: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig4.jpg" /> 
Figura 4: Características de las hifas en C. albicans haploide en respuesta a diferentes inductores moleculares. Las gráficas muestran las longitudes de las hifas (A) y los volúmenes de las hifas (B) en cepas de C. albicans haploide, en respuesta al inductor indicado. Control: YPD, el control del medio que no induce formación de hifas. Los datos representan la mediana ± intervalos de confianza del 95%, provenientes de tres experimentos biológicos independientes, con n = 50 células. Los números indicados denotan valores de p, determinados mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. **: p &#60; 0,01, ***: p &#60; 0,001, ****: p &#60; 0,0001, estadísticamente significativo; ns, no significativo: p &#62; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71709/71709fig5.jpg" /> 
Figura 5: Correlación entre los parámetros morfológicos correspondientes con la ploidía de C. albicans. Los gráficos muestran la correlación de Spearman y la regresión lineal entre los parámetros morfológicos utilizados en este estudio, es decir, volumen del hifa y longitud del hifa (A), volumen celular y longitud del hifa (B), volumen celular y volumen del hifa (C), y grosor del hifa y longitud del hifa (D). ρ: coeficiente de correlación de Spearman; R2: coeficiente de determinación obtenido del análisis de regresión lineal; p: valor p. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/71709fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Estirpe</td>
			<td>Especie</td>
			<td>Ploidía</td>
			<td>Genotipo</td>
			<td>Origen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBS138</td>
			<td>Candida glabrata</td>
			<td>Haploide (1n)</td>
			<td>MATα</td>
			<td>ATCC 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC5314</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploide (2n)</td>
			<td>Heterocigoto (MATa/α)</td>
			<td>ATCC MYA-2876</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1132</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploide (2n)</td>
			<td>Homocigoto (MATa/a); arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
			<td rowspan="2">Schaefer, D., Côte, P., Whiteway, M., Bennett, R.J. Barrier Activity in Candida albicans Mediates Pheromone Degradation and Promotes Mating. Eukaryotic Cell. 6 (6), 907–918, doi: 10.1128/ec.00090-07 (2007).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBY1133</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Diploide (2n)</td>
			<td>Homocigoto (MATα/α); arg4Δ/arg4Δ, leu2Δ/leu2Δ, his1Δ/his1Δ, URA3/ura3Δ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY896</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Haploide (1n)</td>
			<td>Homocigoto (MATa); ura3∆::imm434 his4 gal1∆::ura3∆::HIS4</td>
			<td rowspan="2">Hickman, M.A. et al. The ‘obligate diploid’ Candida albicans forms mating-competent haploids. Nature. 494 (7435), 55–59, doi: 10.1038/nature11865 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZY803</td>
			<td>Candida albicans</td>
			<td>Haploide (1n)</td>
			<td>Homocigoto (MATα); his4 ura3Δ::HIS4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Cepas de Candida albicans y Candida glabrata utilizadas en este estudio. La tabla describe las denominaciones, genotipos explícitos, estados de ploidía y la cigosidad del tipo de apareamiento de las cepas fúngicas evaluadas en los ensayos de co-cultivo en placas de pozo con insertos de membrana sin contacto y basados en sobrenadantes libres de células (CFS).
Tabla suplementaria 1: Datos de los análisis estadísticos realizados sobre diversos parámetros morfológicos de C. albicans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria 2: Valores brutos de todas las réplicas biológicas de diversos parámetros morfológicos de C. albicans evaluados en este estudio.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental Table S2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo suplementario 1: Lista de medios utilizados en este estudio con sus composiciones.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71709/Supplemental File 1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Se describen dos enfoques de co-cultivo sin contacto para la evaluación cualitativa y cuantitativa de las respuestas morfológicas fúngicas durante interacciones entre especies. El protocolo demuestra cómo los factores intrínsecos influyen en el crecimiento de hifas, utilizando un ensayo entre especies de Candida como ejemplo. Estos métodos pueden adaptarse fácilmente para investigar la comunicación microbiana entre especies en diversos organismos.

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Incube a 37 grados Celsius con agitación continua a 200 rpm durante 18 horas. Tome la cultivo nocturno. Verifique la morfología de la levadura y la ausencia de contaminación mediante microscopía de luz. Transfiera el cultivo a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue a 5.000 x g durante cinco minutos a 25 grados Celsius. Descarte cuidadosamente el sobrenadante y guarde el botón celular para el ensayo con inserto de membrana. Para la cepa objetivo Candida albicans, inóquese una colonia individual en 5 mililitros de caldo GMM para una cepa diploide, o caldo YPD para una cepa haploide. Incube el cultivo inóculado a 37 grados Celsius con agitación a 200 rpm durante 12 horas. Verifique la densidad óptica del cultivo nocturno a 600 nanómetros. A continuación, diluya el cultivo con GMM precalentado hasta un volumen final de 1 mililitro y una OD final a 600 nanómetros de 0,1.Tomar una placa de cultivo de tejidos estéril de 24 pocillos. Añadir 1 mililitro de suspensión de Candida albicans con una DO a 600 nanómetros de 0,1 en cada pocillo inferior seleccionado, o en la cámara abdominal de una placa de cultivo celular de doble compartimento. A continuación, recuperar el pellet de Candida glabrata y resuspenderlo en 1 mililitro de caldo GMM. Centrifugar a 5.000 x g durante 3 minutos y desechar el sobrenadante. Repetir el lavado dos veces. Resuspender el pellet final en caldo GMM fresco y ajustar la DO a 600 nanómetros de la suspensión celular a cinco. Luego, utilizando fórceps estériles, colocar un inserto de membrana estéril con una membrana de policarbonato de 0,4 micrómetros de poro en cada pocillo funcional. Asegurar firmemente el inserto en los pocillos y dispensar 750 microlitros de la suspensión preparada de Candida glabrata en cada cámara superior o luminal. Cubrir la placa ensamblada e incubarla a 37 grados Celsius, en estático, durante tres horas. Tras la incubación, utilizar fórceps estériles para retirar cada inserto superior y desecharlo de forma segura. Colocar la placa de 24 pocillos sobre un microscopio invertido equipado con óptica DIC y objetivos de 10x, 20x y 40x con distancia de trabajo extra larga para la evaluación morfológica.Después del período de incubación requerido, escanee los fondos de los pocillos con el objetivo de 10x para verificar la distribución uniforme de las células e identificar errores de seguimiento o agrupaciones anómalas. Capture al menos 10 campos de visión separados con el objetivo calibrado de 20x para obtener el conjunto de datos principal de recuento de filamentos y distribución de la población. Para el análisis fenotípico detallado y las mediciones de los límites celulares, capture microfotografías con el objetivo de distancia de trabajo extra larga de 40x. Luego guarde todos los archivos de imagen crudos. Inicie la versión más reciente del software Fiji. Abra la microfotografía objetivo seleccionando Archivo seguido de Abrir. Para medir la longitud del hifa, haga clic en el icono de selección de línea y seleccione la herramienta de línea segmentada. Coloque el cursor en la unión donde el filamento emerge de la pared celular de la levadura madre. Trace el eje longitudinal central del hifa, agregando puntos de anclaje para seguir curvas y giros, y termine en la punta apical. Ejecute el comando de medición usando Control + M en Windows o comando + M en Mac OS para registrar la longitud total, L, en micrómetros en la ventana de Resultados. Utilice la herramienta de pincel para marcar la célula medida y evitar análisis duplicados. Localice la célula de levadura madre unida. Con la herramienta de línea segmentada, dibuje y mida una línea recta a través del eje longitudinal máximo de la célula para registrar el eje mayor, A. Luego dibuje y mida una línea perpendicular al eje mayor a través del tramo transversal más ancho para registrar el eje menor, B. Calcule el volumen de la célula de levadura madre, CV, en micrómetros cúbicos utilizando el modelo de esferoide prolato incluido en el software. Para medir el grosor del hifa, utilice la herramienta de línea segmentada para dibujar una línea de pared externa a pared externa perpendicular al eje de longitud del hifa. Registre el diámetro en tres posiciones equidistantes a lo largo del filamento. Calcule la media aritmética de los tres diámetros para obtener el grosor promedio, d, y divídalo entre 2 para obtener el radio, r. Calcule el volumen total del hifa, HV, en micrómetros cúbicos tratando el filamento no ramificado como un cilindro.Calcule la medición celular media o mediana para cada réplica biológica y utilice estos valores a nivel de réplica para comparaciones estadísticas posteriores. Antes de aplicar métodos paramétricos, evalúe el conjunto de datos de réplicas biológicas en cuanto a normalidad mediante la prueba de Shapiro-Wilk o la prueba de D'Agostino-Pearson. Para una comparación entre dos grupos, utilice una prueba t de Student no pareada y de dos colas cuando el conjunto de datos siga una distribución normal. Tras realizar los análisis estadísticos y preparar las representaciones gráficas, aplique notaciones estadísticas consistentes en todas las figuras.Las células de Candida albicans desarrollaron hifas verdaderas en dos sistemas de ensayo sin contacto, ya sea cuando estuvieron expuestas a células de Candida glabrata separadas por membrana o a sobrenadante libre de células de Candida glabrata filtrado. Por otro lado, las células de control conservaron predominantemente morfologías de levadura y pseudohifas. No se observaron diferencias significativas entre los ensayos de co-cultivo separado por membrana y sobrenadante libre de células filtrado, ambos produjeron longitudes, volúmenes y grosores de hifas comparables.El protocolo permite a los investigadores estudiar la coexistencia de múltiples especies mediante la medición de respuestas morfológicas a la señalización entre especies dentro de comunidades microbianas. El desafío principal aquí consiste en garantizar el intercambio molecular a través de la membrana, lo cual podría abordarse mediante la agitación de la placa y el mantenimiento de una presión hidrostática suficiente. El estudio mediante imágenes en células vivas de la dinámica de los orgánulos podría revelar cómo la comunicación molecular configura mecanísticamente las interacciones entre especies.

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