Un método de chiIRP basado en UV para la identificación verificable de proteínas que interactúan directamente con el ARNnc: desde células cultivadas hasta testículo de ratón

Nuestra investigación desarrolló cPDiRT, un método de reticulación con UV para mapear directamente las interacciones entre ARN y proteínas tanto en células cultivadas como en tejidos nativos, como los testículos, y para dilucidar los mecanismos moleculares de TUG1 en la espermatogénesis. Este protocolo permite el mapeo directo de las interacciones entre ARN y proteínas en una amplia gama de sistemas, desde células cultivadas hasta tejidos nativos intactos. Para comenzar, lave las células GC2 tres veces con PBS para eliminar el medio de cultivo residual.

Luego, agregue tres mililitros de PBS al recipiente y distribúyalo uniformemente antes de la reticulación. Irradie las células en un reticulador ultravioleta de 254 nanómetros con una dosis de 4.000 milijulios por centímetro cuadrado. Recopile las células en PBS y centrifugue la suspensión celular a 3000G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Después de desechar el sobrenadante, pese el sedimento y confirme una masa mínima del sedimento de 500 miligramos por muestra. Recolecte los testículos de ratones macho C57BL6 de cuatro semanas de edad. Lave el tejido testicular descapsulado dos veces con 5 a 10 mililitros de DMEM.

A continuación, incubar 100 miligramos de tejido con 10 mililitros de DMEM que contenga colagenasa IV a un miligramo por mililitro a 37 grados Celsius. Continuar la digestión durante 5 a 15 minutos hasta que se liberen los túbulos seminíferos. Luego, centrifugar la suspensión a 1000G durante un minuto a cuatro grados Celsius y eliminar el sobrenadante.

Lave el sedimento con 5 a 10 mililitros de DMEM. Centrifugue nuevamente la suspensión a 1000G durante un minuto a cuatro grados Celsius. Y re-suspenda el sedimento en tripsina al 0,25 % que contenga un miligramo por mililitro de desoxirribonucleasa I. Incube la suspensión a 37 grados Celsius durante 5 a 15 minutos.

Luego, agregue un volumen igual de DMEM suplementado con 10 %FBS para detener la digestión enzimática. Filtre la suspensión a través de un filtro celular de 70 micrómetros. Centrifugue las células a 2000G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Descarte el sobrenadante y lave el precipitado con 5 a 10 mililitros de PBS. Centrifugue nuevamente la suspensión a 2000G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Re-suspenda la suspensión de células individuales en PBS y distribúyala uniformemente sobre un recipiente de cultivo de 15 centímetros.

Entrecruce las células testiculares como se demostró anteriormente para las células GC2. Omita la irradiación para las células de control. Recopile las células entrecruzadas.

Centrifugar la suspensión a 3000G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y desechar el sobrenadante. Asegurar una masa mínima del precipitado de 500 miligramos mediante la reunión de células testiculares aisladas de al menos 10 a 12 ratones. Después de pesar el precipitado, volver a suspenderlo en tampón de lisis celular en una proporción de 100 miligramos de precipitado por un mililitro de tampón.

Después de agitar en vórtex, sonicar la muestra utilizando un ultrasonido enfocado o un baño ultrasónico hasta que el lisado se vuelva visualmente claro. Luego, distribuir alícuotas de aproximadamente 10 microlitros del lisado en tubos de microcentrifugado para análisis de ARN y proteínas. Añadir 30 microlitros de perlas magnéticas previamente lavadas al lisado.

Incube las muestras a 37 grados Celsius durante 30 minutos con mezcla suave en un horno de hibridación. Coloque las muestras en un soporte magnético durante aproximadamente un minuto o hasta que la solución se vuelva clara. Transfiera el lisado clarificado a un tubo nuevo.

Coloque el nuevo tubo en el soporte magnético. Luego, transfiera el lisado a otro tubo para eliminar cualquier resto de perlas. Añada dos volúmenes de tampón de hibridación templado a 37 grados Celsius a cada muestra.

Añada sondas de ADN biotiniladas en una proporción de un microlitro de solución stock de sonda de 100 micromolar por cada mililitro de lisado. Incube las muestras a 37 grados Celsius con rotación de extremo a extremo durante 12 a 16 horas en un horno de hibridación. Inmediatamente antes de su uso, lave 100 microlitros de perlas magnéticas de estreptavidina tres veces con tampón de lisis celular.

Y elimine el tampón residual después del lavado final. Centrifugue brevemente los tubos de reacción de hibridación. Luego, agregue la muestra hibridada a las perlas lavadas y mezcle suavemente.

Devuelva la suspensión de perlas al tubo original e incube a 37 grados Celsius con agitación durante 30 a 40 minutos. Tras la incubación, centrifugue brevemente las muestras. Coloque los tubos en un soporte magnético durante uno o dos minutos, o hasta que la solución se vuelva clara.

Luego, deseche el sobrenadante. Para lavar las perlas, agregue un mililitro del tampón de lavado e incube los tubos en el horno de hibridación a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Después de cinco lavados, transfiera del 1 al 10 % de las perlas a un tubo nuevo para el análisis de ARN.

Finalmente, agregue 40 microlitros de tampón de muestra SDS 1X a las perlas restantes. Hierva las muestras a 95 grados Celsius durante 30 minutos para eluir las proteínas e invertir los enlaces cruzados. Recupere las proteínas para el análisis posterior mediante espectrometría de masas.

El análisis de espectrometría de masas mediante ChIRP identificó más de 190 proteínas enriquecidas en relación con el control negativo en células GC2. Con una dosis de UV de 4.000 milijulios por centímetro cuadrado, cPDiRT-MS identificó un conjunto de proteínas más selectivo. Más de dos tercios de estas proteínas se solaparon con las identificadas mediante ChIRP-MS convencional.

La mayoría de las proteínas identificadas con al menos dos péptidos únicos se detectaron de manera reproducible en los replicados biológicos tanto en células GC2 como en testículos de ratón. El análisis de ontología genética de las proteínas identificadas de forma reproducible reveló procesos biológicos ampliamente consistentes con las funciones conocidas de TUG1. La comparación de los conjuntos de datos de células GC2 y testículos de ratón identificó 15 proteínas que estuvieron comúnmente enriquecidas.

La secuenciación mejorada de inmunoprecipitación con reticulación reveló picos de unión claros y específicos en el transcrito TUG1 para PABPC1 y CCT3. cPDiRT permite a los investigadores identificar y cuantificar proteínas que interactúan directamente con un ARN enlazado específico tanto en células en cultivo como en tejidos nativos. El desafío más importante consiste en lograr una reticulación eficiente mediante UV, al tiempo que se garantiza una alta especificidad para las interacciones directas entre ARN y proteínas.

Nuestro protocolo apoyará estudios futuros para aplicar este enfoque a otros ARN y a los tejidos en la reactivación directa del ARN mensajero en acción durante el desarrollo y la reproducción.