Principios de la recombinasa específica de sitio (RSS) Tecnología

Hola, me llamo Frank Buchholz. Soy jefe de grupo en el Instituto Max PL de Biología Celular y Genética Molecular. Y nuestro trabajo se mantiene.

Tenemos dos aspectos en nuestro trabajo. Uno se centra en la selección de ARN I. El otro se enfoca en el desarrollo de recombinasas específicas de sitio para la ingeniería genómica avanzada.

Mi formación es la de biólogo, biólogo molecular, y estudié genética en biología. Posteriormente realicé un doctorado en los Laboratorios Europeos de Biología Molecular en Heidelberg, y luego hice una estancia posdoctoral en San Francisco en la UCSF con Mike Bishop, trabajando en modelos animales de leucemia. El Instituto Max Puncture aquí en Dresde intenta combinar, digamos, al menos dos aspectos diferentes, que son biólogos del desarrollo y biólogos celulares, dentro del intento fundamentalmente de, creo que se podría decir, que su tema básico, básico, es tratar de comprender cómo las células forman tejidos.

Este es básicamente el objetivo general del instituto aquí en Ston. Así que trabajamos en dos campos principalmente. Un campo consiste en realizar cribados por ARNip, intentando identificar funciones novedosas de genes previamente no caracterizados en procesos biológicos.

El otro trata sobre la ingeniería genómica para intentar desarrollar tecnologías que permitan una ingeniería sofisticada de genomas utilizando recombinasas específicas de sitio, específicamente. Aunque las recombinasas específicas de sitio fueron descubiertas, diría yo, en los ochenta; por ejemplo, la recombinasa cre con la que trabajamos fue descubierta a principios de los ochenta. En realidad, es una proteína de fago bacteriano. Por lo tanto, originalmente proviene de un fago bacteriano, es decir, un virus básicamente que infecta bacterias.

Por lo tanto, está muy alejado de lo que se utiliza actualmente, pero se reconoció muy rápidamente que estas enzimas pueden desempeñar funciones muy interesantes que pueden aprovecharse en otros organismos también. Las recombinasas específicas de sitio son proteínas que se unen al ADN, específicamente a una secuencia determinada de ADN, y cuando se unen a estas secuencias diana, son capaces de cortar el ADN y luego reorganizar los sitios, realizando básicamente también el proceso de ligación. Así pues, se pueden reordenar secuencias de ADN mediante esta recombinación específica de sitio, de forma similar a unas tijeras y pegamento que permiten ensamblar secuencias de ADN de una manera en que previamente no estaban ensambladas.

Entonces, estas recombinasas específicas del sitio, como dije, fueron descubiertas originalmente en bacterias o en fagos bacterianos. Posteriormente se analizó si también funcionaban en otros organismos. Y, curiosamente, llevaron a cabo su función también en otros organismos.

Entonces, si tiene un sitio diana de recombinasa específica de sitio en un organismo que ha sido modificado genéticamente, por ejemplo, estas enzimas cumplirán su función. El uso muy destacado de estas recombinasas específicas de sitio, en particular las que no necesitan cofactores, como la recombinasa flip o la recombinasa cre que hemos utilizado como punto de partida para el trabajo del que estamos hablando aquí hoy, es que funcionan sin cofactores.

Y si los expresa en un animal, por ejemplo, o en células de un animal, entonces pueden encontrar las secuencias que reconocen en este organismo y, básicamente, cortar y pegar directamente allí, eliminando ciertas secuencias. Entonces, lo que se ha hecho, o el lugar donde esta enzima se ha utilizado con gran éxito, es en la denominada mutagénesis condicional de ratones, por ejemplo. Supongamos que tiene un gen del cual sabe que es un gen interesante, y desea conocer la función de este gen.

Un experimento muy destacado consiste en crear un denominado ratón knockout. Para ello, como se ha visto recientemente, esta tecnología ha recibido en realidad este año el Premio Nobel, con el fin de realizar esencialmente una eliminación génica en un ratón. Sin embargo, a veces se descubre que al inactivar un gen en un animal, este resulta ser un gen esencial y que el ratón muere muy temprano durante la embriogénesis.

Ahora esto le indica que su gen es muy importante, pero en realidad no le dice cuál es su función. Por lo tanto, un método muy destacado en la actualidad para averiguarlo consiste en realizar una eliminación condicional. Así, lo que se hace es flanquear el gen de interés con sitios diana para estas recombinasas específicas de sitio.

Y eso significa que en estos ratones, el gen se expresará como en los ratones de tipo salvaje. Pero ahora, si cruzas estos ratones con un ratón que expresa la recombinasa CRE, por ejemplo, bajo un promotor específico de tejido, entonces puedes eliminar el gen de interés solo en células específicas que puedes predefinir según el lugar donde se expresa la recombinasa. Y a partir de estos experimentos, también sabemos que estas recombinaciones pueden ser muy eficientes para eliminar secuencias de organismos completos.

Y esto era un requisito previo para nuestra idea de intentar desarrollar una recombinasa que corte en el sitio que habíamos predefinido, el cual hasta ahora había sido una de las principales limitaciones para el desarrollo adicional del sitio. Con las recombinasas específicas, tenías que diseñar el sitio diana de reconocimiento dentro del genoma de una célula de un organismo que quisieras utilizar. Por lo tanto, nos preguntamos: ¿podemos superar esta barrera?

Básicamente utilizando evolución molecular. En la actualidad, las recombinasas específicas de sitio no se utilizan para terapia, que yo sepa. Como dije, eso se debe principalmente a que no se tendrá un sitio diana en el ser humano que sea reconocido por cualquiera de las recombinasas disponibles en la naturaleza.

Por lo tanto, primero deben modificarse y hacerse utilizables en un entorno terapéutico. Ahora mismo apenas estamos al comienzo de saber si esto podría ser posible. El tiempo dirá si realmente somos capaces de desarrollar estas enzimas para su uso terapéutico, y el tiempo dirá si es posible o no.