Name: Imagen de células vivas y seguimiento de células individuales para monitorizar la dinámica clonal y las transiciones de destino en organoides intestinales humanos y murinos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprende a realizar imagen de células vivas y seguimiento individual en organoides intestinales humanos y murinos. Este método permite monitorizar dinámica clonal y transiciones de destino celular en tiempo real con resolución de célula única.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris </td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104-500</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (Advanced DMEM/F12)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement </td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-05</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (40um) </td><td>Greiner Bio-one</td><td>542140</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>con control climático para temperatura y CO2</td></tr><tr><td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME)</td><td>R&amp;D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>Glass bottom plates</td><td>CellVis</td><td>P24-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax </td><td>Gibco </td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco </td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement </td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NEPA electroporation system</td><td>NEPAGENE</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>NucSpot Live</td><td></td><td></td><td>tinta nuclear para células vivas de color rojo lejano</td></tr><tr><td>Noggin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>N002</td><td></td></tr><tr><td>OrganoidTracker</td><td>open source</td><td></td><td>open source https://organoidtracker.org/</td></tr><tr><td>p2T-CAG-mT2TP</td><td>hechas en casa</td><td></td><td>protocolo para generar el plásmido DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR</td><td>hechas en casa</td><td></td><td>protocolo para generar el plásmido DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR </td><td>hechas en casa</td><td></td><td>protocolo para generar el plásmido DOI: 10.1126/science.adr8753</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco </td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Tocris </td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-22</td><td>Peprotech</td><td>200-22</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human R-spondin 1</td><td>Thermo Fisher</td><td>120-38-5UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine EGF</td><td>Thermo Fisher </td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine Noggin</td><td>Thermo Fisher</td><td>250-38-100UG</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin conditioned medium (U-Protein Express)</td><td>IPA Therapeutics</td><td>R001</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td></td><td></td><td>tinta para ADN de células vivas de color rojo lejano</td></tr><tr><td>SB202190 (p38 inhibitor)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>Suspension plate for organoid culture</td><td>Greiner</td><td>665102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue </td><td>Gibco </td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco </td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Wnt surrogate</td><td>U-Protein Express</td><td>&nbsp;pedido personalizado</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3A conditioned medium</td><td>hechas en casa</td><td></td><td>La producción de Wnt3A conditioned medium se puede encontrar aquí:&nbsp; https://doi.org/10.1002/cpim.106</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

imagen de células vivas y seguimiento de células individuales para monitorizar la dinámica clonal y las transiciones de destino en organoides intestinales humanos y murinos

Live-Cell Imaging and Single-Cell Tracking to Monitor Clonal Dynamics and Fate Transitions in Human and Murine Intestinal Organoids

Imagen de células vivas y seguimiento de células individuales para monitorizar la dinámica clonal y las transiciones de destino en organoides intestinales humanos y murinos

The intestinal epithelium undergoes rapid self-renewal through stem cell division, cell differentiation, and migration. Understanding how individual cells ...

Nuestra investigación se centra en estudiar cómo las células individuales toman decisiones sobre su destino y coordinan sus comportamientos dentro del epitelio intestinal autorrenovable. La microscopía óptica no puede resolver un marcador ubicuo, por ejemplo, el compartimento de la membrana de una célula o el citoesqueleto, y atribuirlo concretamente a una célula o a sus vecinas. Sin embargo, los organoides mosáicos pueden ayudar realmente a superar esa limitación.Para comenzar, obtenga los reactivos necesarios y las líneas validadas de organoides intestinales con marcador fluorescente murinos y humanos. Pase ambas líneas de organoides a medio condicionado con Wnt tres días antes de la generación de organoides mosáicos para promover la expansión de células madre y maximizar la viabilidad celular durante la disociación. Prepare BME al 5 % en DMEM. Recubra cada pocillo de una placa de 48 pocillos con 20 microlitros del BME preparado para proporcionar una capa adhesiva delgada para la adhesión celular, luego incube a 37 grados Celsius durante una hora. A continuación, disuelva el BME añadiendo medio base frío con hielo. Recoja los organoides de cada línea por separado mediante centrifugación a 300 g durante cinco minutos a 4 grados Celsius. Disocie los organoides en células individuales incubándolos en una solución enzimática de desprendimiento celular durante 5 a siete minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius. Utilizando una pipeta P1000, pipetee repetidamente la suspensión para ayudar a la disociación mecánica. Supervise la disociación bajo un microscopio de campo claro. Detenga la reacción añadiendo medio base en exceso frío con hielo cuando se observen predominantemente células individuales o fragmentos pequeños de organoides de 2 a 10 células. Luego, forme un pellet celular mediante centrifugación a 300 g durante cinco minutos a 4 grados Celsius. Evalúe la viabilidad celular y cuente las células viables utilizando exclusión con azul de tripano. Combine las dos poblaciones celulares en la proporción deseada para obtener un total de 300.000 células en 500 microlitros de medio condicionado con Wnt, suplementado con 10 micromolar de clorhidrato de Y-27632 para organoides mosáicos murinos o medio de expansión para cultivos de organoides mosáicos humanos. Mezcle bien mediante pipeteo suave. Luego, retire el medio de recubrimiento de las placas de 48 pocillos y siembre la suspensión celular en los pocillos recubiertos. Centrifugue la placa a 200 g durante cinco minutos a temperatura ambiente e incube a 37 grados Celsius. Prepare una punta de pipeta P200 doblando su extremo. Después de 24 horas, desprenda mecánicamente la capa celular raspando con la punta de pipeta doblada, luego enjuague completamente con medio base frío con hielo. Recoja los agregados desprendidos mediante centrifugación a 300 g durante tres minutos a 4 grados Celsius, sin aplicar cizallamiento mecánico adicional. Re-suspenda los agregados en BME y siembre en portadores de muestra compatibles con imágenes. Cultive los agregados sembrados en medio ENR para organoides murinos y en medio de expansión para organoides mosáicos humanos.Utilice cámaras de imagen con fondo de vidrio para garantizar la compatibilidad óptica con objetivos confocales de alta apertura numérica. Siembre la suspensión de organoides en matriz de cultivo (BME) en forma de una cúpula delgada cerca del centro del fondo de vidrio. Incube la placa a 4 grados Celsius durante 5 a 10 minutos para permitir que los organoides se desplacen hacia el fondo de vidrio por gravedad. Transfiera la placa a 37 grados Celsius y permita que la BME se solidifique durante 20 a 30 minutos. Añada 500 microlitros de medio de crecimiento precalentado a cada pocillo. Permita que los organoides se recuperen y establezcan su morfología durante al menos 24 horas antes de iniciar la adquisición de imágenes en vivo. Adquiera imágenes de lapso de tiempo a largo plazo y realice seguimiento a nivel de célula individual y reconstrucción de linajes para el análisis posterior.La formación exitosa de mosaicos se caracterizó por una distribución tipo sal y pimienta o por límites definidos entre las dos poblaciones, dependiendo del grado de disociación utilizado. La disociación completa a nivel de célula individual produjo mosaicos tipo sal y pimienta, mientras que la fragmentación suave preservó pequeños cúmulos clonales. Cuando una célula individual, que coexpresa un reportero de interés, está rodeada por vecinas no marcadas, sus dinámicas del citoesqueleto durante la migración, división o extrusión pueden atribuirse inequívocamente a esa célula. Los reporteros nucleares de H2B facilitaron la identificación de constelaciones celulares informativas dentro del mosaico, y se extrajeron mediciones por célula a partir de los datos de seguimiento, tales como la tasa de división durante la vida útil y la dinámica de intensidad del reportero. Las células caliciformes activaron y mantuvieron una expresión alta de MUC2-mNeonGreen durante todo el período de imagen, mientras que las células de Paneth mostraron una activación inicial de MUC2-mNeonGreen seguida de una disminución progresiva de la señal y posterior activación de DEFA5-dsRed. La cuantificación a nivel de célula individual confirmó esta transición secuencial a nivel de células individuales. Las curvas promedio de intensidad en múltiples células seguidas confirmaron que este patrón fue consistente a nivel poblacional, con precursores de células de Paneth mostrando una relación inversa característica entre las señales de MUC2-mNeonGreen y DEFA5-dsRed.Este protocolo permite a los investigadores estudiar cómo una célula individual remodela su citoesqueleto, por ejemplo durante la división, durante la migración o, por ejemplo, durante la extrusión en un tejido intacto. La consideración importante es elegir la relación de marcado, ya que las células reporteras escasas aíslan las señales de células individuales, mientras que las células no marcadas escasas revelan las respuestas del entorno. En estudios futuros se pueden combinar reporteros de destino con marcado en mosaico en un organoide para vincular los compromisos de destino con la dinámica del citoesqueleto a nivel de célula individual.

live-cell-imaging-single-cell-tracking-to-monitor-clonal-dynamics

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Seguimiento de Dinámica de injerto muscular en pequeños animales por En Vivo Fluorescente de imágenes

Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

En este protocolo de vídeo damos una explicación paso a paso de la transducción lentiviral en organoides del epitelio intestinal primario y del procesamiento y análisis posterior de estos cultivos mediante RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica.

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

Se detallan los protocolos para el cultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), la transfección transitoria de marcadores de crecimiento de microtúbulos marcados con fluorescencia, la obtención de imágenes de células vivas y el análisis automatizado de la dinámica de crecimiento de microtúbulos en interfase.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

Aquí, presentamos imágenes de células vivas que es un método de microscopía no tóxico que permite a los investigadores estudiar el comportamiento de las proteínas y la dinámica nuclear en las células de levadura de fisión viva durante la mitosis y la meiosis.

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitotica. Nuestra aplicación de imágenes de lapso de tiempo permite al usuario identificar células en varias etapas de la mitosis, rastrear e identificar defectos mitoticos, y analizar la dinámica del husillo y el destino de las células mitoticas al exponerse a fármacos antimitoticos.

Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

Toda la estructura 3D y el contenido celular de los organoides, así como su parecido fenotípico con el tejido original se pueden capturar utilizando el protocolo de imágenes 3D de resolución de una sola célula descrito aquí. Este protocolo se puede aplicar a una amplia gama de organoides que varían en origen, tamaño y forma.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.

Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza

Presentamos un método para la adquisición de cursos de tiempo reportero de fluorescencia de células individuales utilizando matrices micropatterned. El protocolo describe la preparación de matrices unicelulares, la configuración y el funcionamiento de la microscopía de lapso de tiempo de barrido de células vivas y una herramienta de análisis de imágenes de código abierto para la preselección automatizada, el control visual y el seguimiento de los cursos de tiempo de fluorescencia integrados en...

Imágenes de células vivas de matrices unicelulares (LISCA) - una técnica versátil para cuantificar la cinética celular

El presente protocolo describe un método para detectar especies reactivas de oxígeno (ROS) en los organoides murinos intestinales utilizando imágenes cualitativas y ensayos de citometría cuantitativa. Este trabajo se puede extender potencialmente a otras sondas fluorescentes para probar el efecto de compuestos seleccionados en ROS.

Análisis del estrés oxidativo en organoides intestinales murinos utilizando una sonda fluorogénica sensible a las especies reactivas de oxígeno

Aprende a realizar imagen de células vivas y seguimiento individual en organoides intestinales humanos y murinos. Este método permite monitorizar dinámica clonal y transiciones de destino celular en tiempo real con resolución de célula única.

Imagen de células vivas y seguimiento de células individuales para monitorizar la dinámica clonal y las transiciones de destino en organoides intestinales humanos y murinos (Video) | JoVE Journal

Imagen de células vivas y seguimiento de células individuales para monitorizar la dinámica clonal y las transiciones de destino en organoides intestinales humanos y murinos

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