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<ol>
	<li>Alberti S. Phase separation in biology. Curr Biol. 2017;27(20):R1097-102.</li>
	<li>Rabouille C, Alberti S. Cell adaptation upon stress: the emerging role of membrane-less compartments. Curr Opin Cell Biol. 2017;47:34-42.</li>
	<li>Boeynaems S, et al. Protein phase separation: a new phase in cell biology. Trends Cell Biol. 2018;28(6):420-35.</li>
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	<li>Kathe NC, Novakovic M, Allain FHT. Buffer choice and pH strongly influence phase separation of SARS-CoV-2 nucleocapsid with RNA. Mol Biol Cell. 2024;35(5):ar73.</li>
	<li>Novakovic M, Schmoll J, Emmanouilidis L, Allain FHT. Using solution NMR to characterize biomolecular condensates under biphasic conditions. J Vis Exp. 2026;(230):e70530.</li>
	<li>Novakovic M, et al. LLPS REDIFINE allows the biophysical characterization of multicomponent condensates without tags or labels. Nat Commun. 2025;16(1):4628.</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>cualquier marca está bien</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18-well chamber slides</td><td>ibidi</td><td>81816</td><td>para STORM</td></tr><tr><td>agarose, low gelling temperature</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>grado de biología molecular</td></tr><tr><td>agarose, ultra pure</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>channel slides</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>para microscopía</td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dye, NHS chemistry</td><td>Jena Biosciences</td><td>FP-201-CY5</td><td>para el etiquetado de proteínas</td></tr><tr><td>D2O (deuterium oxide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>easyFRAP</td><td>Koulouras et al. 2018</td><td>N/A</td><td>https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/</td></tr><tr><td>Everspark 2.0 dSTORM buffer</td><td>idylle</td><td>KMO|ETE+</td><td></td></tr><tr><td>FUS NTD protein</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>expresado recombinantemente en nuestro laboratorio, como se describe en la referencia 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>heating block or water bath</td><td>cualquier marca está bien</td><td>N/A</td><td>cualquier marca o modelo servirá</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>image analysis software</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NMR spectrometer</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>750 MHz, sonda de temperatura ambiente PATXI, ver referencia 13 para más detalles (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)</td></tr><tr><td>NMR tube</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>3 mm, de vidrio</td></tr><tr><td>P10, P20, P200 and P1000 pipettes</td><td>cualquier marca está bien</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pCp-Cy3-dye</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1706-CY3</td><td>para el etiquetado de ARN</td></tr><tr><td>poly(A) RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>transcrito in vitro in-house en nuestro laboratorio, longitud aprox 50 nucleótidos, como se describe en Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>s2m RNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>transcrito in vitro in-house en nuestro laboratorio, longitud 45 nucleótidos, secuencia: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', como se describe en Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 nucleocapsid protein</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>expresado recombinantemente en nuestro laboratorio, como se describe en Kathe et al. Mol Biol Cell 2024</td></tr><tr><td>software for plotting (e.g. R)</td><td>R-Project</td><td>Versión 4.2.1</td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>STORM microscope</td><td>Nikon N-STORM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ThunderSTORM plugin</td><td>Ovesny et al. 2014</td><td>N/A</td><td>https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/</td></tr><tr><td>tips for the used pipettes</td><td>cualquier marca está bien</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin</td><td>Bruker</td><td>Versión 3.2 y 4.1</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr></tbody></table>

estabilización de proteínas y condensados de arn en hidrogeles de agarosa de baja fusión para mediciones biofísicas cuantitativas

Stabilizing Protein and Protein&#8212;RNA Condensates in Low-Melting Agarose Hydrogels for Quantitative Biophysical Measurements

Estabilización de proteínas y condensados de ARN en hidrogeles de agarosa de baja fusión para mediciones biofísicas cuantitativas

Biomolecular condensates formed by liquid&#8211;liquid phase separation are increasingly recognized as fundamental organizational units of the cell, with ...

Por lo tanto, nuestra investigación se centró en el desarrollo de un protocolo estandarizado de inclusión en agarosa para inmovilizar los condensados biomoleculares en tres dimensiones, al tiempo que se preservan sus propiedades dinámicas. Los condensados tienden a moverse, fusionarse entre sí o adherirse a las superficies, lo que dificulta ciertas mediciones. Este protocolo de inclusión en agarosa aborda estas limitaciones.Para comenzar, pese la cantidad adecuada de agarosa de baja fusión o agarosa convencional y añádala a un tubo de 1,5 mililitros que contenga tampón de gotas. Caliente el stock de agarosa a 80-90 grados Celsius en un bloque térmico o baño de agua, y disuelva completamente la agarosa mediante vortex durante aproximadamente 10 minutos. Equilibre el stock de agarosa a 37 grados Celsius para agarosa de baja fusión, o a 55 grados Celsius para agarosa convencional, en el bloque térmico o baño de agua.Verifique que la solución permanezca clara y líquida a esta temperatura. Compruebe la temperatura del stock de agarosa con un termómetro. Precaliente todos los materiales que entrarán en contacto directo con la agarosa a aproximadamente 37 grados Celsius colocándolos en un bloque calefactor o en un incubador durante dos o tres minutos.Reúna los reactivos necesarios para preparar el tampón de gotas, los componentes separadores de fases y los aditivos adicionales para las muestras. Equilibre todas las soluciones preparadas a temperatura ambiente. Calcule los volúmenes necesarios de tampón de gotas, stock de agarosa, componentes separadores de fases y aditivos complementarios para la muestra.Como valores iniciales, utilice una concentración final de agarosa del 0,3 al 0,5 % peso por volumen para ensayos biofísicos estándar y del 0,8 al 1,0 % peso por volumen para experimentos de estabilización a largo plazo. Añada primero los volúmenes calculados de tampón y agarosa, seguidos por los aditivos y los componentes que separan fases, en un tubo precalentado de 1,5 mililitros.Mantenga el tubo en el bloque calefactor o en el baño de agua y aspire y expulse la mezcla varias veces con la pipeta, evitando burbujas de aire. Utilizando una pipeta, transfiera rápidamente la muestra sobre el portaobjetos de microscopía. Deje que la muestra forme un gel a temperatura ambiente durante cinco a diez minutos, luego mida la muestra según el protocolo estándar de microscopía.Los gotas formadas con la proteína N y poli-A en presencia de agarosa de baja fusión al 0,5 % peso por volumen tenían aproximadamente el mismo tamaño que las gotas formadas sin agarosa de baja fusión tras cinco minutos a temperatura ambiente. Sesenta minutos después de la preparación de la muestra, las gotas embebidas en agarosa no cambiaron de tamaño, mientras que los condensados sin agarosa de baja fusión mostraron un aumento drástico en tamaño debido a la fusión y la humectación de la superficie. La recuperación de la fluorescencia tras el blanqueo fotónico y la difusión aparente de las gotas fueron muy similares con agarosa de baja fusión y sin ella.Por lo tanto, este protocolo permite a los investigadores obtener imágenes y cuantificar gotas durante largos periodos de tiempo, al tiempo que conservan su comportamiento dinámico. El mayor desafío al realizar este protocolo consiste en controlar adecuadamente tanto la temperatura del agarosa como el momento adecuado para el encapsulado. Una vez encapsulados, los condensados pueden estudiarse mediante una amplia variedad de técnicas de microscopía u otros métodos biofísicos, como la RMN.

stabilizing-protein-proteinrna-condensates-low-melting-agarose

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este vídeo, que muestran las técnicas experimentales utilizadas para la fabricación de cumplimiento, la matriz extracelular (ECM) sustratos recubiertos adecuadas para el cultivo celular, y que son susceptibles de microscopía de fuerza de tracción y observando los efectos de la rigidez de ECM en el comportamiento celular.

Preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular

Este video muestra una técnica de separación de proteínas basada en poliacrilamida desnaturalizante. Esta técnica ayuda en la identificación preliminar de proteínas en función de sus pesos moleculares.

Electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio para el análisis de proteínas: una técnica para separar y visualizar proteínas basada en el peso molecular

Este video muestra la separación bidimensional de fibras amiloides basada en electroforesis con gel de agarosa y detergente semidesnaturalizante. La técnica separa los agregados polimórficos de amiloide en función de su tamaño heterogéneo.

Electroforesis bidimensional semidesnaturalizante en gel de agarosa: una técnica para separar fibras de amiloide polimórficas en función de la heterogeneidad de tamaño

En este video, demostramos un método de electroforesis en gel bidimensional que separa proteínas individuales de una mezcla compleja de proteínas obtenidas de tejidos tumorales de adenoma hipofisario humano no funcional (NFPA). Las proteínas se separan en función de su carga eléctrica en la primera dimensión y se separan aún más en función de los pesos moleculares en la segunda dimensión.

Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida: una técnica de separación para el análisis de proteínas en mezclas complejas de proteínas basada en la carga y el peso molecular

Las técnicas tradicionales para la fabricación de poliacrilamida (PA) geles que contienen sondas fluorescentes implican intercalando un gel entre una superficie adherente y un portaobjetos de vidrio. Aquí, mostramos que el revestimiento de esta diapositiva con poli-D-lisina (PDL) y sondas fluorescentes localiza las sondas dentro de 1,6 m de la superficie del gel.

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

Se presenta un protocolo para la producción de tRNA (UUU) y el análisis de tRNA (UUU) en complejo con la enzima TcdA mediante ensayos de retardo de gel de agarosa.

Ensayos de Retardo de Gel de ARNt de Proteína-ARNt para el Análisis del<emN</em<sup6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Una nueva técnica de espectrométricas de fuerza-abrazadera se utiliza para investigar las propiedades mecánicas de muestras de bajo volumen basados en proteína hidrogel ancladas entre un motor de bobina de voz y un sensor de fuerza. Un analógico proporcional-integral-derivado (PID) sistema permite la fijación de la fuerza experimentada en el protocolo deseado.

Pinza de fuerza espectrométricas para la caracterización de Hidrogeles basados en proteínas

Un protocolo se presenta para probar rápidamente la estabilidad térmica de las proteínas en una variedad de condiciones a través de ensayos de cambio térmico y diferencial fluorimetría de nano. Los sistemas tampón, sales y aditivos, juntos con tres pantallas de estabilidad única, se analizan con proteínas para identificar los tampones adecuados para estudios funcionales y estructurales.

Cómo estabilizar proteínas: pantallas estabilidad térmica cambio ensayos y diferencial de Nano fluorimetría en el proyecto de Virus X

Se ha demostrado que muchas proteínas intrínsecamente desordenadas participan en la formación de condensados biomoleculares altamente dinámicos, un comportamiento importante para numerosos procesos celulares. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de una sola molécula para cuantificar la dinámica por la cual las proteínas interactúan entre sí en condensados biomoleculares en células vivas.

Medición de una sola molécula de la dinámica de interacción de proteínas dentro de condensados biomoleculares

Aquí presentamos protocolos para metodologías de RMN, DIFfusión RErestricted of INvisible speciEs (REDIFINE) y CONdensate DEtectioN por transferencia de magnetización SEmi-sólida (CONDENSE-MT), que permiten la caracterización cuantitativa y sin etiqueta de condensados biomoleculares bajo condiciones bifásicas, revelando la partición molecular, la dinámica de intercambio, la hidratación de condensados y la estructura de gotas sin sedimentación ni marcado.

Uso de RMN en solución para caracterizar condensados biomoleculares bajo condiciones bifásicas

Aunque la rigidez de la matriz extracelular (MEC) es un regulador clave del comportamiento celular, los mecanismos subyacentes de detección y transducción siguen siendo poco claros. Para abordar esto, proporcionamos protocolos para crear sustratos a base de poliacrilamida y silicona con rigidez ajustable para avanzar en nuestra comprensión de la diafonía célula-ECM.

Generación de sustratos de matriz extracelular de poliacrilamida y silicona con rigidez definida para aplicaciones en biología celular

ETH Zürich.  Aquí presentamos un método robusto para inmovilizar físicamente condensados separados en fase líquido-líquido dentro de una matriz porosa de hidrogel de agarosa de baja fusión sin alterar su dinámica interna de líquidos. El enfoque minimiza la sedimentación de gotas, la coalescencia y los artefactos de humectación superficial, permitiendo imágenes reproducibles y análisis biofísicos cuantitativos durante períodos de horas.

Estabilización de proteínas y condensados de ARN en hidrogeles de agarosa de baja fusión para mediciones biofísicas cuantitativas

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