Name: Medición de la reparación de roturas de doble cadena del ADN mediante el ensayo DR-white en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprende a medir la reparación de roturas de doble cadena del ADN mediante el ensayo DR-white en Drosophila melanogaster. Este protocolo permite distinguir entre recombinación homóloga, unión de extremos y annealing de hebra simple.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este método fue desarrollado mientras J.R.L. era beneficiario de una beca de investigación de la AFAR otorgada por la Federación Americana para la Investigación del Envejecimiento. &#160;Este trabajo también fue financiado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (1R15GM110454 y 1R15GM129628) concedido a J.R.L. Las figuras fueron elaboradas con la ayuda de BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

1. Ensayo DR-white
<ol>
	<li>Cruces genéticos (Figura 3A) 
	NOTA: Para protocolos estándar de cultivo y genética de Drosophila, consulte &#34;Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics&#34; por Ralph J. Greenspan17. La información sobre los genotipos de las cepas se proporciona en la Tabla de materiales.
	<ol>
		<li>Mantenga las moscas a 25 °C con ciclos de 12 h de luz/oscuridad en alimento estándar para Drosophila, espolvoreado con levadura activa.</li>
		<li>Prepare cinco viales de choque térmico cruzando 8–10 hembras vírgenes DR-white con 3–5 machos que porten un transgén I-SceI (Cruce 1, Figura 3A) por vial. 
		NOTA: Se pueden utilizar diferentes transgenes I-SceI según la aplicación. En este protocolo, se utilizó el transgén hsp70-I-SceI para la inducción mediante choque térmico11. Para evitar la expresión fuga del I-SceI en generaciones anteriores, es importante asegurarse de que los transgenes DR-white e I-SceI solo se combinen en la misma mosca en esta generación.</li>
		<li>El mismo día, prepare botellas de expansión de una cepa y w. Estas serán las moscas de prueba. Tres botellas de expansión son suficientes para aproximadamente 60–80 cruces de prueba.</li>
		<li>Cultive los viales de choque térmico y las botellas de expansión y w a 25 °C durante 3 días.</li>
		<li>El tercer día, pase los viales de choque térmico y las botellas de expansión y w a alimento fresco para servir como conjunto de respaldo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Choque térmico/inducción de roturas de doble cadena (DSB) 
	NOTA: Si no utiliza un transgén I-SceI inducible por choque térmico, pase al paso 1.2.5, que generalmente se realiza 3 días después del paso 1.1.5.
	<ol>
		<li>Envejezca los viales de choque térmico durante 3 h a 25 °C para asegurar que toda la descendencia haya progresado a través de la transición materno- zigótica.</li>
		<li>Someta los viales originales a un choque térmico en un baño de agua a 38 °C durante 1 h. Asegúrese de que el nivel de agua esté al menos a la altura de la base del tapón de algodón para que las larvas no puedan trepar por encima del nivel del agua.</li>
		<li>Monitoree la temperatura del baño de agua cada 15 min y manténgala dentro de 38 ± 0.5 °C, ya que los resultados de inducción y reparación dependen de la duración y temperatura del choque térmico.</li>
		<li>Devuelva los viales a 25 °C.</li>
		<li>Al día siguiente, agregue 1/3 de una toalla de laboratorio doblada al alimento para absorber el exceso de humedad. Si el alimento está seco, agregue aproximadamente 100 µL de agua a la toalla de laboratorio. Agregue un tapón de algodón a las botellas de expansión y w.</li>
		<li>Cultive los viales sometidos al choque térmico durante 6 días adicionales a 25 °C, o hasta que las moscas comiencen a emerger.</li>
		<li>Limpie los viales de respaldo y las botellas de expansión 3 días después del traslado. Agregue un tapón de algodón a las botellas de expansión y w de respaldo aproximadamente 4 días después de la limpieza. 
		NOTA: Si es necesario, los viales de respaldo pueden someterse a choque térmico según los pasos 1.2.1 a 1.2.6 y procesarse como se describe a continuación.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cruces de prueba
	<ol>
		<li>Recoja moscas sometidas al choque térmico que porten los transgenes DR-white e I-SceI durante 4–5 días después del inicio de la emergencia para reducir el sesgo por etapa de desarrollo. 
		NOTA: Las moscas que han recibido con éxito el choque térmico y portan los transgenes DR-white e I-SceI presentan ojos mosaicistas debido a eventos de reparación durante el desarrollo embrionario y larval que se han incorporado a los tejidos adultos. El grado de mosaicismo no siempre se correlaciona con los eventos de reparación en la línea germinal y, por lo tanto, no debe ser un factor determinante al seleccionar moscas experimentales para los cruces de prueba (paso 1.3.3).</li>
		<li>Recoja hembras vírgenes y w durante 5 días. Recoja 5 hembras vírgenes por número esperado de muestras. Recoja de las botellas de expansión de respaldo tan pronto como comiencen a emerger.</li>
		<li>Prepare los viales de prueba cruzando un macho sometido al choque térmico con 4–5 hembras vírgenes y w (Cruce 2; Figura 3A). Seleccione machos al azar del conjunto reunido en el paso 1.3.1 para reducir el sesgo por etapa de desarrollo. Cultive los cruces de prueba a 25 °C. 
		NOTA: Para evitar el entrecruzamiento entre DR-white e I-SceI, generalmente se analizan las líneas germinales masculinas; sin embargo, también se puede analizar la descendencia femenina. Si se analiza la descendencia femenina, los viales de prueba del Cruce 2 se preparan en una proporción de 2:5 hembras:machos y w y se cultivan durante 5–6 días (paso siguiente) para asegurar la productividad.</li>
		<li>Verifique la productividad 4 días después de preparar los viales de prueba para evaluar cuándo deben limpiarse. 
		NOTA: Confirme que se han puesto suficientes huevos para garantizar al menos 20 descendientes cuantificables, pero no permita que los cultivos se sobrepoblen, ya que las moscas podrían quedar atrapadas en el alimento.</li>
		<li>Cuando los viales de prueba estén listos (hasta 4–5 días después de establecer los cruces de prueba), deseche las moscas y agregue 1/3 de una toalla de laboratorio doblada al alimento para absorber el exceso de humedad. 
		NOTA: Los machos pueden recolectarse en este momento si se requieren análisis adicionales (por ejemplo, genotipificación molecular).</li>
		<li>Cultive los viales de prueba durante 5–6 días adicionales a 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cuantificación 
	NOTA: Aproximadamente 25 viales de prueba se preparan para cada condición en cada experimento genético (por ejemplo, mutantes homocigotos y controles heterocigotos). Cada experimento genético se repite 2–3 veces, y los datos de los viales individuales se agrupan.
	<ol>
		<li>Cuantifique la descendencia del Cruce 2 (Figura 3A) durante aproximadamente 9 días después de que las primeras moscas comiencen a emerger.</li>
		<li>Anestesie las moscas usando CO2 o transfiriéndolas a un vial vacío sin alimento y congelándolas a -20 °C durante al menos 30 min. 
		NOTA: Si las moscas se congelan, pueden cuantificarse hasta varios días después.</li>
		<li>Coloque las moscas sobre una almohadilla para moscas y cuantifique los fenotipos adecuados (Figura 3A). Incluya solo viales con al menos 20 moscas cuantificadas en el conjunto de datos.
		<ol>
			<li>Para cuantificar, primero separe las moscas que portan el casete DR-white (utilizando la fluorescencia positiva para la proteína fluorescente roja [RFP+] como marcador), luego cuantifique el color de los ojos y del cuerpo.</li>
			<li>El transgén y+ ligado al casete DR-white produce un color marrón intermedio del cuerpo que no es completamente silvestre. Para distinguir entre ausencia de DSB/replicación no homóloga (NHEJ) (cuerpo marrón;&#160;y+&#160;w-) y recombinación por alineación de extremos (SSA) (cuerpo amarillo;&#160;y-&#160;w-), compare las moscas con la descendencia y w que no posee el cromosoma DR-white (RFP-). Los eventos de SSA tendrán el mismo color amarillo que estas moscas. Cuantifique como ausencia de DSB/NHEJ a las moscas que sean más oscuras (más marrones) que estas. 
			NOTA: Las desviaciones respecto a los fenotipos descritos en la Figura 3A&#160;pueden indicar contaminación, y el vial no debe cuantificarse. Aunque pueden cuantificarse moscas muertas completas, las moscas dañadas deben descartarse si no es posible determinar sus fenotipos.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Análisis TIDE (Figura 4)
<ol>
	<li>Extracción de ADN genómico (ADN-g)18
	<ol>
		<li>Recoger moscas (o larvas) sometidas a choque térmico que porten ambos transgenes DR-white e I-SceI, como la progenie del Cruce 1 (Figura 3A).</li>
		<li>Colocar una mosca individual en un tubo microcentrífugo de 1,5 mL y congelar rápidamente (por ejemplo, en un baño de hielo seco/etanol o nitrógeno líquido). 
		ADVERTENCIA: Manipular el hielo seco, el nitrógeno líquido, el etanol, el isopropanol y otros productos químicos utilizando equipo de protección personal adecuado y siguiendo los procedimientos de seguridad institucionales. 
		PUNTO DE PAUSA:&#160; Las muestras pueden almacenarse a -80 °C y procesarse posteriormente si es necesario. Si se analizan moscas o larvas, utilizar una sola mosca o larva por muestra. Si se analizan tejidos más pequeños (por ejemplo, cerebros, discos imaginales), agrupar muestras para aumentar el rendimiento de ADN.</li>
		<li>Homogeneizar cada muestra en 50 µL del tampón A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM ácido etilendiaminotetraacético [EDTA]; 100 mM cloruro de sodio; 0,5 % dodecilsulfato de sodio [SDS]) utilizando un homogeneizador eléctrico.</li>
		<li>Incubar las muestras en un baño de agua a 65 °C durante 30 min.</li>
		<li>Añadir 100 µL del tampón B (1,4 M acetato de potasio, 4,3 M cloruro de litio) a cada muestra y mezclar brevemente invirtiendo los tubos. 
		NOTA: Si se utilizan moscas enteras, puede requerirse un volumen mayor para homogeneizar completamente las muestras. En tal caso, mantener una relación volumétrica de 1:2 entre tampón A y tampón B.</li>
		<li>Incubar las muestras en hielo durante al menos 30 min.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a aproximadamente 16.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Transferir 125 µL del sobrenadante clarificado a nuevos tubos microcentrífugos de 1,5 mL. Evitar cualquier precipitado.</li>
		<li>Añadir 100 µL de isopropanol al 100 % a temperatura ambiente por cada 125 µL de sobrenadante y mezclar brevemente invirtiendo los tubos.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a aproximadamente 16.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de ADN. 
		NOTA: El pellet de ADN puede no ser visible en esta etapa. Anotar la orientación de los tubos al colocarlos en la microcentrífuga y aspirar en la cara opuesta a donde se espera que esté el pellet.</li>
		<li>Lavar los pellets con 250 µL de etanol al 70 % frío, luego mezclar brevemente invirtiendo suavemente los tubos.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a aproximadamente 16.000 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet. 
		NOTA: El pellet puede ser más visible tras el lavado con etanol. Si no lo es, ver la Nota del paso 2.1.11.</li>
		<li>Dejar los tubos destapados a temperatura ambiente para evaporar cualquier resto de etanol. Evitar el secado excesivo del pellet, ya que podría no reconstituirse completamente.</li>
		<li>Añadir 20 µL de agua libre de nucleasas y permitir que los pellets se reconstituyan durante la noche a 4 °C. 
		PUNTO DE PAUSA: Si el pellet de ADN no se ha disuelto completamente, puede añadirse más agua.</li>
		<li>Al día siguiente, invertir suavemente los tubos y medir la concentración de ADN. Almacenar las muestras a -20 °C si no se van a procesar inmediatamente. 
		NOTA: Para la extracción a partir de una sola mosca, los rendimientos suelen ser aproximadamente de 100 ng/µL. Es importante obtener muestras de alta calidad. La relación de absorbancia A260/A280 debe estar entre 1,7 y 2,0. Valores fuera de este rango indican contaminantes como proteínas. La relación A260/A230 debe estar entre 2,0 y 2,2. Valores fuera de este rango indican contaminantes como etanol y sales del tampón. Las muestras con bajo rendimiento y mala calidad pueden dar lugar a una amplificación por PCR deficiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
	<ol>
		<li>Amplificar a través de Sce.white mediante PCR utilizando 100 ng de ADN-g y los cebadores DR-white_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) y DR-white_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC), siguiendo las instrucciones del fabricante. Incluir una muestra de control de mosca DR-white (es decir, la cepa parental DR-white, sin presencia del transgen I-SceI). Utilizar las siguientes condiciones de ciclado: 94 °C durante 3 min; {94 °C durante 30 s; descenso por etapas a 66 °C (-0,5 °C/ciclo) durante 30 s; 72 °C durante 30 s} x 16 ciclos; {94 °C durante 30 s; 58 °C durante 30 s; 72 °C durante 30 s} x 20 ciclos; 72 °C durante 5 min; mantener a 12 °C. 
		NOTA: Si se utiliza un reactivo diferente, puede ser necesario ajustar las condiciones de ciclado.</li>
		<li>Correr aproximadamente 2 µL del producto de PCR en un gel diagnóstico de agarosa al 1 % en tampón tris-acetato-EDTA (TAE) para confirmar la amplificación de Sce.white. El tamaño esperado del amplicón es aproximadamente de 1,7 kb.</li>
		<li>Purificar los amplicones de Sce.white mediante PCR y medir la concentración de ADN.</li>
		<li>Secuenciar el producto de PCR purificado utilizando el cebador DR-white_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC). 
		NOTA: Normalmente secuenciamos 40 ng de producto de PCR purificado, pero esto puede variar según las instrucciones del servicio de secuenciación.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análisis TIDE 
	NOTA: La mayoría de los errores al usar el script R de TIDE se deben a un formato incorrecto del código.
	<ol>
		<li>Descargar los paquetes R necesarios (es decir, sangerseqR y Biostrings) desde Bioconductor.org. Utilizar la barra de búsqueda para localizar la última versión de cada paquete.</li>
		<li>Analizar los cromatogramas de secuencia para asegurarse de que sean de buena calidad. Analizar únicamente cromatogramas con poco o ningún fondo antes del sitio de rotura.</li>
		<li>Descargar los archivos de trazado de secuencia (con extensión .ab1) y colocar todos los archivos de trazado en una única carpeta del ordenador. Simplificar los nombres de los archivos de secuencia tanto como sea posible (por ejemplo, F1, Het2, Hom3) para facilitar las ediciones del script en los siguientes pasos.</li>
		<li>Abrir el script R de TIDE (Archivo Suplementario 1) en el entorno de desarrollo integrado (IDE) de RStudio (ver la Tabla de Materiales). En el panel Fuente, localizar la línea que comienza con Control &#60;- (Archivo Suplementario 2A) y escribir exactamente el nombre del archivo de secuencia de control tal como se guardó, incluyendo la extensión .ab1, entre comillas. 
		NOTA: La "secuencia de control" es la secuencia de la PCR obtenida de la cepa parental DR-white sin el transgen I-SceI ni inducción.</li>
		<li>Localizar la línea que comienza con samplename &#60;- c( y escribir cada nombre de archivo de secuencia de muestra dentro de los paréntesis (Archivo Suplementario 2A). Incluir la extensión .ab1, colocar cada nombre de archivo entre comillas separadas y separar los nombres con comas.</li>
		<li>Guardar el archivo editado del script R de TIDE en la misma carpeta que los archivos de secuencia a analizar. Mantener el nombre del archivo simple para evitar errores en los siguientes pasos.</li>
		<li>En el IDE, navegar hasta la carpeta de TIDE utilizando la pestaña Archivos en el panel de Salida (Archivo Suplementario 2B).</li>
		<li>Hacer clic en el desplegable Más y seleccionar Abrir Nuevo Terminal Aquí (Archivo Suplementario 2C). Se abrirá un nuevo terminal en el panel de Consola (abajo a la izquierda).</li>
		<li>En el terminal recién abierto, escribir “R” y pulsar Intro (Archivo Suplementario 2D).</li>
		<li>Una vez que R esté en ejecución en el terminal, ejecutar el script R de TIDE escribiendo source(&#34;TIDE_analysis.R&#34;) y pulsar Intro (Archivo Suplementario 2E). El terminal ejecutará el script y generará una representación gráfica (Archivo Suplementario 2F) y un archivo .csv que contiene los datos brutos para cada muestra (Archivo Suplementario 2G y Archivo Suplementario 3). Los archivos de salida se guardan en la misma carpeta que el script R y los archivos de secuencia. 
		NOTA: Si se vuelve a ejecutar el mismo script R, cualquier nuevo archivo .csv generado sobrescribirá los anteriores. Si se realizan múltiples análisis sobre los mismos archivos, hacer una copia de la carpeta.</li>
		<li>Analizar los datos abriendo cada archivo .csv.
		<ol>
			<li>Interpretar los datos brutos como proporciones de indels en la secuencia de la muestra. La conversión génica por recombinación homóloga desde la secuencia de reconocimiento de I-SceI hasta la secuencia silvestre de SacI produce la eliminación canónica de 23 pb; el script informa de este valor de HR en una fila separada al final de la salida (Archivo Suplementario 2G). El valor de 0-indel representa ausencia de DSB o NHEJ sin indels. Sumar todos los demás valores de indel para obtener NHEJ con procesamiento. La suma de NHEJ con procesamiento y HR es el número total de eventos detectables de reparación de DSB.</li>
			<li>Calcular las proporciones de las vías de reparación entre los eventos detectables de reparación de DSB utilizando las siguientes ecuaciones: 
			Proporción de NHEJ con procesamiento = (NHEJ con procesamiento) / (NHEJ con procesamiento + HR) 
			Proporción de HR = (HR) / (NHEJ con procesamiento + HR) 
			NOTA: Aproximadamente 10–15 muestras se utilizan para cada condición en cada experimento genético (por ejemplo, mutantes homocigotos y controles heterocigotos). Cada experimento genético se repite 2–3 veces, y los datos individuales se agrupan.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.</li>
	<li>Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.</li>
	<li>Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.</li>
	<li>Figueroa-Gonz&#225;lez G, P&#233;rez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.</li>
	<li>Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.</li>
	<li>Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.</li>
	<li>Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.</li>
	<li>Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.</li>
	<li>Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.</li>
	<li>Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.</li>
	<li>Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.</li>
	<li>Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.</li>
	<li>Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.</li>
	<li>Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.</li>
	<li>Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.</li>
	<li>Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.</li>
	<li>Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.</li>
	<li>Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.</li>
	<li>McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.</li>
	<li>Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.</li>
	<li>Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.</li>
	<li>Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.</li>
	<li>Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.</li>
	<li>Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.</li>
	<li>Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.</li>
	<li>Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.</li>
	<li>Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.</li>
	<li>Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.</li>
	<li>Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos financieros ni no financieros que revelar.

La versatilidad del sistema DR-white es un factor clave que contribuye a su impacto pasado y futuro en el campo de la reparación del ADN. En primer lugar, la secuencia de integración attB dentro del constructo informador DR-white permite a los investigadores dirigir el informador a numerosas ubicaciones dentro del genoma de Drosophila21, y ya existen varias líneas dirigidas disponibles22. En segundo lugar, la disponibilidad de diferentes transgenes I-SceI, como la expresión inducida por choque térmico mediante el promotor hsp70 (este estudio), la expresión constitutiva mediante el promotor ubiquitin23 y la expresión en la línea germinal premeiótica mediante el promotor Bam24, proporciona múltiples contextos de desarrollo y específicos de tejido para explorar la reparación de roturas de doble cadena. Independientemente del&#160;I-SceI transgén utilizado, los cruces genéticos deben planificarse cuidadosamente para asegurar que el transgén I-SceI solo se introduzca en el cruce final, garantizando así la inducción adecuada de roturas de doble cadena. Es importante tener en cuenta que las frecuencias de reparación pueden variar significativamente según la ubicación genómica del DR-white y/o el transgén I-SceI&#160;utilizado. Experimentos futuros podrían comparar aún más las ubicaciones genómicas y los transgenes I-SceI para determinar si el contexto genómico o la especificidad tisular influyen en la reparación de roturas de doble cadena.
Una ventaja particular del ensayo DR-white y sus derivados es que pueden identificar la reparación de roturas de doble cadena (DSB) mediante recombinación homóloga, NHEJ con procesamiento y, en la mayoría de los casos, SSA. Aunque fue diseñado para detectar fenotípicamente eventos de reparación en la línea germinal, el sistema también permite el análisis de tejidos somáticos mediante el algoritmo de análisis TIDE. A pesar de estas ventajas, existen algunas limitaciones de este ensayo que deben tenerse en cuenta. En particular, el ensayo DR-white podría subestimar las frecuencias de recombinación homóloga (HR). Como ocurre en otros ensayos con reporteros genéticos que utilizan DSB inducidas por nucleasas, la reparación mediante HR a partir de una cromátida hermana (HR entre cromátidas hermanas) es indistinguible de un evento sin DSB o de NHEJ sin procesamiento. Por lo tanto, al menos algunos eventos de la clase Sin DSB/NHEJ podrían ser en realidad eventos de HR. Dada esta limitación, los resultados que comparan factores genéticos (como líneas mutantes) deben interpretarse con cautela. Otras limitaciones del ensayo incluyen la imposibilidad de cuantificar eventos preméioticos que no produjeron progenie viable. Por ejemplo, eventos de DSB que no se repararon y que provocaron la muerte celular no se registrarán en la progenie. Aunque la fertilidad general podría ser una medida cualitativa de la muerte de células germinales, podrían requerirse ensayos celulares (como TUNEL). Además, el análisis mediante el script de R de TIDE solo proporciona la proporción de eventos detectables en una población celular. Para determinar los resultados específicos de secuencias de indel, se requiere la secuenciación de eventos individuales de reparación mediante secuenciación de ADN multiplex.
El ensayo DR-white ya ha tenido un profundo impacto en el estudio de la reparación de roturas de doble cadena (DSB). Su aplicación ha identificado factores que contribuyen a la reparación de DSB en organismos multicelulares, incluyendo la edad25, el sexo26, la ubicación de la DSB22,26, la ubicación de la secuencia donadora15, el ciclo celular y el tipo de tejido26. Además, hemos utilizado este ensayo para identificar varias proteínas que también determinan la elección de la vía de reparación y/o la reparación de secuencias divergentes en Drosophila, incluyendo Msh627, Blm28, Rif116 y CtIP16,29. De hecho, el uso bien establecido de Drosophila como organismo modelo genético, con proteínas conservadas de reparación del ADN, proporciona un sistema simple y multicelular para investigar los factores genéticos, celulares y del organismo que contribuyen a la reparación de DSB en contextos biológicos complejos.

La integridad genómica se ve frecuentemente amenazada por lesiones en el ADN, entre las cuales las roturas de doble cadena (DSBs) son particularmente tóxicas. Si no se reparan, estas roturas pueden provocar pérdida genética, reordenamientos cromosómicos y muerte celular1. Por ello, las células han desarrollado múltiples vías para reparar las DSB. La unión de extremos no homólogos (NHEJ) liga directamente los dos extremos de la DSB, pudiendo introducir indels en el sitio de la rotura; la anillación de cadena sencilla&#160;(SSA) aprovecha secuencias complementarias que flanquean el sitio de rotura para la reparación, lo que resulta en deleciones en dicho sitio; mientras que la recombinación homóloga (HR) utiliza una secuencia homóloga como molde para la reparación2,3.
Históricamente, los estudios sobre la reparación de roturas de doble cadena (DSB) se han limitado a ensayos bioquímicos4 o sistemas de célula individual, como bacterias5,6, levaduras7,8 y cultivos de células de mamífero9,10. Aunque estos modelos han sido fundamentales para identificar las proteínas esenciales de la reparación y sus mecanismos, carecen de la complejidad biológica de un organismo pluricelular. Drosophila melanogaster se ha convertido en un sistema modelo pluricelular popular para estudiar la reparación del ADN. Sin embargo, muchos ensayos actuales están diseñados específicamente para vías de reparación concretas11; utilizan aberraciones cromosómicas grandes, como la excisión del elemento P12; o requieren análisis moleculares que consumen mucho tiempo13. El ensayo DR-white aborda estos desafíos al proporcionar un indicador genético sencillo de la reparación del ADN en Drosophila14. Este estudio ofrece un flujo de trabajo completo, práctico y detallado paso a paso para realizar ensayos genéticos y moleculares destinados a medir la reparación de DSB en el ADN mediante el bien establecido ensayo DR-white.
El ensayo emplea dos repeticiones directas del gen Drosophila white (w), que confiere el color rojo silvestre del ojo (Figura 1). Ambas copias son no funcionales: la primera, Sce.white, contiene una inserción que lleva la secuencia de reconocimiento de la meganucleasa I-SceI en un sitio SacI silvestre e introduce un codón de parada prematuro; la segunda, iwhite, está truncada tanto en los extremos 5’ como 3’ y sirve como molde para la reparación por HR. Un transgén Drosophila yellow (y+), que confiere el color marrón silvestre del cuerpo, está presente entre las dos repeticiones de white. Dado que el casete DR-white está integrado en un fondo mutante y w, las moscas DR-white son fenotípicamente de cuerpo marrón silvestre y de ojos blancos mutantes.
Las roturas de doble cadena (DSB) pueden inducirse en Sce.white cruzando moscas DR-white con moscas que portan un transgén I-SceI. La reparación de las DSB en la línea germinal premeiótica puede medirse mediante el análisis de la descendencia de un cruce de prueba. La reparación por NHEJ da como resultado el fenotipo parental de cuerpo marrón y ojos blancos (Figura 1A), mientras que la reparación por HR restaura la secuencia silvestre de white y produce descendencia de cuerpo marrón y ojos rojos (Figura 1B). La reparación por SSA de la DSB o un entrecruzamiento mitótico provoca la pérdida del transgén yellow intermedio, dando lugar a moscas de cuerpo amarillo y ojos blancos (Figura 1C). Para analizar los resultados de la reparación en células somáticas, hemos adaptado el algoritmo Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) para detectar específicamente la reparación por NHEJ con procesamiento y por HR en el ensayo DR-white15,16.
El ensayo DR-white ofrece varias ventajas frente a los ensayos de reparación del ADN previamente establecidos en Drosophila. Dado que los cortes se generan y reparan en la línea germinal, los resultados de la reparación pueden detectarse fácilmente mediante análisis fenotípico. Al mismo tiempo, el ensayo es extremadamente versátil. Aunque está diseñado principalmente para medir la reparación por recombinación homóloga (HR), puede detectar las tres vías de reparación. También hemos desarrollado dos plantillas adicionales y funcionales de reparación (Figura 2). La plantilla iwhite.mu contiene 28 polimorfismos de nucleótido único (SNP) silenciosos y produce descendencia de ojos rojos (Figura 2A), lo que facilita los estudios de longitudes de tramos de conversión génica (GCT) y la reparación por HR entre secuencias divergentes14.&#160;La plantilla iwhiteΔ9 contiene una deleción de nueve pares de bases en el sitio SacI de tipo silvestre y da como resultado descendencia de ojos anaranjados (Figura 2B). Esta característica permite a los investigadores rastrear la reparación por HR a partir de plantillas distintas, una característica única del ensayo DR-white15.

<table><tbody><tr><td>Pestillos de 0,5 mL libres de RNAsa/DNAsa</td><td>Fisher Scientific</td><td>12141363</td><td>Para la homogenización de muestras para la extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>Bolas de algodón</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Para el cultivo estándar de Drosophila</td></tr><tr><td>Incubadora refrigerada por Peltier para Drosophila</td><td>Shel Lab</td><td>SRI6PF</td><td>Para el cultivo estándar de Drosophila</td></tr><tr><td>Línea de Drosophila: y[1] w[1]</td><td>Centro de Líneas de Drosophila Bloomington&amp;nbsp;</td><td>RRID:BDSC 1495</td><td></td></tr><tr><td>Línea de Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+}&amp;nbsp;</td><td>Laboratorio LaRocque</td><td>N/A</td><td>Creada por el laboratorio LaRocque mediante recombinación estándar de la línea RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) del Centro de Líneas de Drosophila Bloomington; disponible bajo solicitud al autor correspondiente</td></tr><tr><td>Línea de Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>Laboratorio LaRocque</td><td>N/A</td><td>Ensayo DR-white integrado en la línea RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); disponible bajo solicitud al autor correspondiente</td></tr><tr><td>Línea de Drosophila: y[2] w[&amp;Delta;] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]</td><td>Laboratorio LaRocque</td><td>N/A</td><td>Ensayo DR-white.mu integrado en la línea RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); disponible bajo solicitud al autor correspondiente</td></tr><tr><td>Línea de Drosophila: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]</td><td>Laboratorio LaRocque</td><td>N/A</td><td>Donador iwhite&amp;Delta;9 integrado en la línea RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP&amp;rsquo;}ZH-51C); disponible bajo solicitud al autor correspondiente</td></tr><tr><td>Cierres para frascos de Drosophila Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-100</td><td>Para el cultivo estándar de Drosophila</td></tr><tr><td>Stereo microscopio fluorescente (RFP)</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1-FL</td><td>Para el manejo y clasificación estándar de Drosophila&quot;fly pushing&quot; basado en fluorescencia</td></tr><tr><td>Almohadilla FlyStuff para Drosophila</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td>Para el manejo estándar de Drosophila&quot;fly pushing&quot;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua MyBath de 4 L</td><td>Midwest Scientific</td><td>MB-2000-4</td><td>Para&amp;nbsp; choque térmico</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518LY</td><td>Para la cuantificación de ADN</td></tr><tr><td>Medio Nutri-fly Fórmula Bloomington</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-121</td><td>Para el cultivo estándar de Drosophila</td></tr><tr><td>Homogeneizador motorizado sin cordón Pellet Pestle</td><td>DWK Life Sciences</td><td>K749540-0000</td><td>Para la homogenización de muestras para la extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>Botellas de polipropileno</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>Para el cultivo estándar de Drosophila</td></tr><tr><td>Viales de poliestireno</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td>Para el cultivo estándar de Drosophila, incluyendo choque térmico</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleótido DR-white_8f</td><td>N/A; cualquier servicio de síntesis de oligonucleótidos es suficiente</td><td>N/A</td><td>5'GTGGATCAGGTGATCCAGG</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleótido DR-white_8a</td><td>N/A; cualquier servicio de síntesis de oligonucleótidos es suficiente</td><td>N/A</td><td>5&amp;rsquo;-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC</td></tr><tr><td>Primer/oligonucleótido DR-white_9f</td><td>N/A; cualquier servicio de síntesis de oligonucleótidos es suficiente</td><td>N/A</td><td>5&amp;rsquo;-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC</td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Posit</td><td>Versión 2023.06.1+524</td><td>Versión gratuita descargable; cualquier versión de R Studio es aceptable, aunque los datos presentados fueron analizados usando&amp;nbsp; la versión 2023.06.1+524</td></tr><tr><td>Paquetes de R Studio: Biostrings</td><td>Bioconductor.org (Versión 3.24)</td><td>Versión 2.76.0</td><td>El script de R solicitará al usuario instalar este paquete</td></tr><tr><td>Paquetes de R Studio: sangerseqR</td><td>Bioconductor.org (Versión 3.24)</td><td>Versión 1.44.0</td><td>El script de R solicitará al usuario instalar este paquete</td></tr><tr><td>SapphireAMP Fast PCR</td><td>Takara</td><td>RR350B</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscopio</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>Para el manejo estándar de Drosophila&quot;fly pushing&quot;</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean up&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de la reparación de roturas de doble cadena del adn mediante el ensayo dr-white en drosophila melanogaster

Measuring DNA Double-Strand Break Repair Using the DR-white Assay in Drosophila melanogaster

Los estudios tradicionales sobre la reparación de roturas de doble cadena de ADN (DSB) suelen limitarse a investigaciones bioquímicas o sistemas unicelulares (por ejemplo, células, levaduras). Para facilitar el estudio de la reparación de DSB en un organismo pluricelular, utilizamos el ensayo DR-white en Drosophila melanogaster. El ensayo DR-white es un ensayo sencillo pero versátil de reportero de reparación de DSB que contiene una única secuencia de reconocimiento I-SceI, la cual puede ser escindida mediante la expresión de la meganucleasa I-SceI. La expresión de I-SceI puede inducirse de forma constitutiva, mediante choque térmico o bajo otros promotores, permitiendo investigar la reparación específica de tejidos o etapas del desarrollo. Una ventaja principal de este ensayo es que puede distinguir los resultados de reparación que implican recombinación homóloga (HR), unión de extremos no homólogos (NHEJ) y apareamiento de cadenas simples (SSA). Este artículo proporciona un protocolo detallado para el ensayo DR-white ya establecido, incluyendo un flujo de trabajo paso a paso para inducir DSB en la línea germinal premeiótica y analizar fenotípicamente los eventos de reparación mediante la cuantificación de la descendencia. También describe el análisis molecular de los eventos de reparación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación y el script en R denominado Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). Este protocolo ofrece una herramienta útil para investigar los mecanismos genéticos y moleculares de la reparación del ADN en un modelo de organismo completo.

Drosophila requiere Rad51 para la reparación mediante recombinación homóloga
Los experimentos germinales exitosos producen las clases fenotípicas esperadas mostradas en la Figura 3A y al menos 20 descendientes cuantificables por frasco. Los fenotipos inesperados o menos de 20 descendientes cuantificables indican contaminación o productividad insuficiente y deben excluirse según lo especificado en el paso 1.4.3. Para el análisis TIDE, las muestras exitosas producen un amplicón de aproximadamente 1,7 kb y cromatogramas con poco fondo antes del sitio de rotura; el ADN de bajo rendimiento o contaminado y los cromatogramas ruidosos son subóptimos y no deben analizarse.
Al utilizar el ensayo DR-white con una fuente de I-SceI inducible por choque térmico, la frecuencia de reparación por HR en moscas de tipo salvaje es del 38,5 ± 1,2 % (media ± EE), mientras que la SSA ocurre aproximadamente en un 3,2 ± 0,35 % (Figura 3B&#160;y Archivo Suplementario 4). Rad51 (codificada por el homólogo spnA en Drosophila) es necesaria para el paso de invasión de la hebra en la recombinación homóloga14,19. Por lo tanto, la pérdida de Rad51 debería dar lugar a una HR ineficiente. De hecho, en un fondo DmRad51-/-, la reparación por HR se reduce al 1,3 ± 0,4 %, con un aumento concomitante en la reparación por SSA (34,5 ± 1,8 %; Figura 3B&#160;y Archivo Suplementario 4)14. Esto se debe muy probablemente a que los eventos de reparación comprometidos con la recombinación homóloga se reparan alternativamente mediante el apareamiento de cadenas simples de las secuencias repetidas de white.
Drosophila contribución de CtIP a la reparación eficiente por HR en tejidos somáticos
El algoritmo TIDE permite la medición de la elección de la vía de reparación en células somáticas. En un fondo no mutante, la NHEJ con procesamiento ocurre en el 59,0 % de los eventos de reparación detectables, y la HR ocurre en el 41,0 % (Figura 4B&#160;y Archivo Suplementario 4). CtIP desempeña un papel importante en la iniciación de la reparación por HR al promover la escisión de extremos de ADN20. Por consiguiente, en un fondo DmCtIP-/-, la elección de la vía de HR se reduce notablemente en células somáticas, del 41,0 % en controles heterocigotos al 10,9 % en mutantes homocigotos (Figura 4B y Archivo Suplementario 4)16. Esto sugiere que en Drosophila, CtIP contribuye a la reparación por HR, pero no es esencial para ella.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig1.jpg" /> 
Figura 1: Ensayo del reportero de roturas de doble cadena DR-white y resultados de reparación. El ensayo de repetición directa de white contiene dos copias no funcionales del gen white: Sce.white (con una inserción de 23 pb que incluye el sitio de reconocimiento I-SceI y que introduce un codón de parada prematuro) e iwhite (secuencia dadora truncada en los extremos 5′ y 3′). Cruzar moscas que contienen DR-white y un transgén I-SceI produce una rotura de doble cadena específica en un sitio que puede analizarse fenotípicamente o molecularmente. Los fenotipos resultantes son: (A) descendencia con ojos blancos (y+ w−), lo que indica ausencia de rotura de doble cadena, recombinación homóloga entre cromátidas hermanas o reparación por NHEJ; (B) descendencia con ojos rojos (y+ w+), lo que indica recombinación homóloga intracromosómica que restaura la secuencia SacI de tipo silvestre a partir de la dadora iwhite; y (C) descendencia con cuerpo amarillo y ojos blancos (y− w−), lo que indica unión de extremos de cadena sencilla (SSA) o entrecruzamiento mitótico. Figura adaptada de Do et al.14. Abreviaturas: CO = entrecruzamiento; DR-white = repetición directa de white; DSB = rotura de doble cadena; HR = recombinación homóloga; NHEJ = unión de extremos no homólogos; SSA = unión de hebras de cadena sencilla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig2.jpg" /> 
Figura 2: Derivados del ensayo DR-white. (A) El ensayo DR-white.mu contiene 28 SNP silenciosos en la secuencia donadora iwhite.mu, lo que genera una divergencia de secuencia del 1,4 % entre las repeticiones directas. La conversión génica de polimorfismos individuales varía entre los eventos de HR y puede determinarse mediante secuenciación. (B) DR-white con el donador iwhiteΔ9 distingue la recombinación interhomóloga de la intracromosómica. La HR a partir del donador intracromosómico iwhite restaura la secuencia silvestre SacI y produce descendencia con ojos rojos. La HR a partir del donador interhomólogo iwhiteΔ9 produce descendencia con ojos anaranjados porque la deleción de 9 pb disminuye la expresión de white. La figura adaptada de Do et al.14 y Fernandez et al.15. Abreviaturas: DSB = rotura de doble cadena; HR = recombinación homóloga; SNP = polimorfismo de un solo nucleótido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig3.jpg" /> 
Figura 3: Flujo experimental para detectar los resultados de la reparación de roturas de doble cadena en la línea germinal premeiótica. (A) El cruce 1 combina el sistema reportero DR-white (o un derivado) con un transgén I-SceI (en este ejemplo, en el cromosoma dos). La descendencia que contiene tanto el ensayo DR-white como el transgén I-SceI mantiene los eventos de reparación en sus tejidos germinales y somáticos. Para analizar eventos individuales de reparación en la línea germinal premeiótica, la descendencia que porta ambos transgenes se cruza con moscas de prueba y w (Cruce 2), y la descendencia se puntúa como se describe en la Figura 1. (B) Eventos individuales de reparación de roturas de doble cadena en la línea germinal de moscas silvestres (n = 106 líneas germinales) y mutantes homocigotos para DmRad51 (n = 46 líneas germinales). **P &#60; 0,01; ****P &#60; 0,0001 mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Las barras representan las medias; las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Los datos fueron reanalizados de Do et al.14. Abreviaturas: ANOVA = análisis de varianza; CO = entrecruzamiento; DSB = rotura de doble cadena; HR = recombinación homóloga; NHEJ = unión de extremos no homólogos; SEM = error estándar de la media; SSA = hibridación de cadena simple. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/72635/72635fig4v2.jpg" /> 
Figura 4: Flujo experimental para detectar los resultados de la reparación de roturas de doble cadena mediante el seguimiento de indels por descomposición (Tracking of Indels by DEcomposition). (A) Moscas que portan DR-white y un transgén inducible I-SceI se analizan mediante extracción de ADN genómico (gDNA), amplificación por PCR en el sitio de la rotura de doble cadena (DSB), secuenciación Sanger y análisis TIDE con el script en R. (B) Datos representativos de mutantes DmCtIP-/-&#160; (n = 23) y controles heterocigotos DmCtIP+/-&#160; (n = 31). Los eventos de reparación detectables se calculan como recombinación homóloga (HR) más unión de extremos no homólogos (NHEJ) con procesamiento, excluyendo la ausencia de DSB o NHEJ sin indels. ****P &#60; 0,0001 mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Las barras representan las medias; las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Los datos fueron reanalizados de Thomas et al.16. Abreviaturas: ANOVA = análisis de varianza; DSB = rotura de doble cadena; gDNA = ADN genómico; HR = recombinación homóloga; NHEJ = unión de extremos no homólogos; PCR = reacción en cadena de la polimerasa; SEM = error estándar de la media; TIDE = seguimiento de indels por descomposición (Tracking of Indels by DEcomposition). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/72635fig4largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1: Script de R para TIDE, para identificar inserciones y deleciones en cromatogramas de secuencias en relación con un control sin DSB. El nombre de archivo de control editable por el usuario, los nombres de archivo de las muestras y la secuencia diana de I-SceI se indican cerca del final del script. Las entradas requeridas, los archivos de salida y su interpretación se describen en la sección 2.3. Se requieren los paquetes sangerseqR y Biostrings.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 1.R" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: Guía paso a paso con capturas de pantalla del flujo de trabajo del script de R para TIDE. Los paneles ilustran las acciones del software descritas en la sección 2.3.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 2 (1).pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: Ejemplo de resultados de TIDE y cálculos de eventos de reparación. El valor 0-indel representa ausencia de DSB o NHEJ sin indels; la fila HR separada representa el producto canónico de deleción de 23 pb; y todos los porcentajes restantes de indels se suman como NHEJ con procesamiento. La reparación detectable total se calcula como HR más NHEJ con procesamiento.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File 3.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 4: Datos brutos que sustentan la Figura 3B y la Figura 4B, organizados en hojas de trabajo editables separadas. Estos datos fueron reanalizados a partir de los estudios previamente publicados citados en las leyendas correspondientes de las figuras.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/72635/Supplemental File S4_R1_v2.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El ensayo DR-white es un ensayo genético versátil con función de reportero para detectar los resultados de la reparación de roturas de doble cadena del ADN en el organismo pluricelular Drosophila melanogaster.

Medición de la reparación de roturas de doble cadena del ADN mediante el ensayo DR-white en Drosophila melanogaster

Los estudios tradicionales sobre la reparación de las roturas de doble cadena (DSB) del ADN se limitan frecuentemente a investigaciones bioquímicas o sistemas unicelulares (p. ej., células, ...

Nuestro laboratorio se interesa en el campo de la integridad del genoma, centrándose en cómo las células reparan las roturas de doble cadena del ADN. A diferencia de otros ensayos de reparación del ADN, el ensayo DR-white en Drosophila mide la reparación de roturas de doble cadena en contextos multicelulares, incluyendo células somáticas y células de la línea germinal.Después de completar los cruces genéticos y la inducción de roturas de doble cadena, permita que la descendencia del cruce con el tester se acumule. A partir del momento en que emergen las primeras moscas, puntúe la descendencia durante aproximadamente nueve días. Anestesie las moscas utilizando dióxido de carbono, o transfiéralas a un vial vacío sin alimento y congélelas a -20 grados Celsius durante al menos 30 minutos. Coloque las moscas sobre una almohadilla para moscas. Para la puntuación, identifique las moscas que portan la repetición directa del gen white o el casete DR-white mediante la fluorescencia de RFP. Evalúe el color de los ojos y del cuerpo. El transgén y-plus vinculado al casete DR-white produce un color corporal marrón intermedio que no es completamente tipo silvestre. Compare estas moscas con la descendencia amarilla white negativa para RFP, que carece del cromosoma DR-white, para distinguir la ausencia de rotura de doble cadena o la unión de extremos no homólogos de la unión de hebras simples. Clasifique las moscas con cuerpos más oscuros y más marrones como ausencia de rotura de doble cadena o unión de extremos no homólogos. Incluya únicamente los viales con al menos 20 moscas puntuadas en el conjunto de datos.Para el análisis molecular de los eventos de reparación, recolecte las moscas sometidas a choque térmico que porten ambos transgenes, DR-white y I-SceI, tal como se indica en la descendencia del Cruce 1. Coloque moscas individuales en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros y congele rápidamente las muestras en una ba&ntilde;o de hielo seco y etanol. Homogenice cada muestra en 50 microlitros de tamp&oacute;n A utilizando un homogenizador el&eacute;ctrico. A continuaci&oacute;n, incube las muestras en un ba&ntilde;o de agua a 65 grados Celsius durante 30 minutos. A&ntilde;ada 100 microlitros de tamp&oacute;n B a cada muestra y mezcle brevemente invirtiendo los tubos. Incube las muestras en hielo durante al menos 30 minutos, luego centrif&uacute;gelas a aproximadamente 16.000 g durante 15 minutos a 4 grados Celsius. Transfiera 125 microlitros del sobrenadante clarificado a un tubo microcentr&iacute;fugo nuevo de 1,5 mililitros, evitando cualquier precipitado. A&ntilde;ada 100 microlitros de isopropanol y mezcle brevemente invirtiendo el tubo. Centrif&uacute;guese las muestras a aproximadamente 16.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de ADN. Lave el pellet con 250 microlitros de etanol al 70% fr&iacute;o, y mezcle suavemente invirtiendo el tubo. Centrif&uacute;gese las muestras a aproximadamente 16.000 g durante cinco minutos a 4 grados Celsius y aspire nuevamente el sobrenadante. Deje el tubo destapado a temperatura ambiente para evaporar el etanol residual sin sobressecar el pellet. Luego, a&ntilde;ada 20 microlitros de agua libre de nucleasas y permita que el pellet se reconstituya durante la noche a 4 grados Celsius. Al d&iacute;a siguiente, golpee suavemente el tubo para mezclar y mida la concentraci&oacute;n de ADN.Amplifique a través de la región Sce.white por PCR utilizando 100 nanogramos de ADN genómico y los cebadores DR-white directo y reverso. Incluya el ADN genómico de una mosca control DR-white que carece del transgén I-SceI, luego realice la reacción utilizando condiciones de ciclado adecuadas. Sombre aproximadamente 2 microlitros del producto de PCR en un gel al 1 % de Tris-acetato-EDTA para confirmar la amplificación de Sce.white. Verifique que el amplicón tenga aproximadamente 1,7 kilobases, luego purifique los amplicones de Sce.white. Mida la concentración de ADN y secuencie el producto de PCR purificado utilizando el cebador de secuenciación DR-white.Después de descargar los paquetes de R requeridos, examine los cromatogramas de secuencia y seleccione únicamente aquellos con poco o ningún fondo previo al sitio de corte para el análisis. Descargue los archivos de trazado de secuencia con la extensión .ab1. Coloque todos ellos en una única carpeta del ordenador y simplifique los nombres de los archivos de secuencia tanto como sea posible. Abra el script de R para el Seguimiento de Indels mediante DEscomposición o TIED en el entorno de desarrollo integrado de RStudio. En el panel de origen, localice la línea que comienza con control e ingrese el nombre del archivo de secuencia de control exactamente como se guardó, incluyendo la extensión entre comillas. Localice la línea que comienza con nombre de muestra e ingrese cada nombre de archivo de secuencia de muestra dentro de los paréntesis, colocando cada nombre de archivo entre comillas separadas y separándolos con comas. A continuación, guarde el script de R de TIED editado en la misma carpeta que las secuencias a analizar. En el entorno de desarrollo integrado, navegue hasta la carpeta TIED utilizando la pestaña Archivos en el panel de salida. Haga clic en el menú desplegable Más y seleccione Abrir nueva terminal aquí. En la terminal recién abierta, escriba R y presione Intro. Una vez que R esté en ejecución, ejecute el script de R de TIED escribiendo el comando source con el nombre del archivo del script y presione Intro. El script genera una representación gráfica y un archivo de valores separados por comas que contiene los datos brutos de cada muestra. Abra cada archivo de valores separados por comas e interprete los datos brutos como las proporciones de indels en la secuencia de la muestra. Finalmente, identifique la eliminación canónica de 23 pares de bases informada por separado en la parte inferior de la salida como el valor de recombinación homóloga. Interprete el valor de indel 0 como ausencia de rotura de doble cadena o unión de extremos no homólogos sin indels, y sume los valores restantes de indel para determinar la unión de extremos no homólogos con procesamiento.Los experimentos exitosos en línea germinal produjeron las clases fenotípicas esperadas y al menos 20 descendientes analizables por frasco. En moscas de tipo salvaje que expresaban I-SceI inducible por choque térmico, la recombinación homóloga ocurrió en aproximadamente el 38,5 % de la descendencia, en comparación con el 3,2 % para el apareamiento de cadena simple. En un fondo mutante homocigótico para DmRad51, la reparación por recombinación homóloga se redujo a aproximadamente el 1,3 %, con un aumento simultáneo de la reparación por apareamiento de cadena simple hasta cerca del 34,5 %. En células somáticas de un fondo no mutante, la unión de extremos no homólogos con procesamiento representó aproximadamente el 59 % de los eventos de reparación detectables, y la recombinación homóloga el 41 %. En un fondo mutante homocigótico para DmCtIP, la elección de la vía de recombinación homóloga se redujo al 10,9 %.Este protocolo puede aplicarse a diversos tejidos, etapas de desarrollo y ubicaciones genómicas para determinar los factores que afectan la reparación. Además, este ensayo se ha modificado para medir resultados de reparación, como las longitudes de las secuencias de conversión génica y la preferencia por la plantilla de reparación. Este ensayo de reparación del ADN puede utilizarse para determinar diversos factores implicados en la reparación mediante mutantes genéticos en Drosophila.

measuring-dna-double-strand-break-repair-using-dr-white-assay

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En este artículo se describen las buenas prácticas agrarias basadas en la...

El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

En este video, describimos la técnica de microscopía de inmunofluorescencia para detectar proteínas específicas de respuesta al daño del ADN localizadas en los sitios de roturas de doble cadena del ADN en células mononucleares humanas. Las proteínas son reconocidas por anticuerpos primarios específicos, que a su vez se unen a anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos que emiten fluorescencia durante la visualización microscópica, lo que permite la visualización de las proteínas como...

Microscopía de inmunofluorescencia para el análisis de roturas de doble cadena de ADN

La epidermis de embriones de fase muy tardía embriones de Drosophila ofrece un sistema in vivo para el análisis de la respuesta herida de punción rápida y se pueden combinar con las manipulaciones genéticas o tratamientos químicos de microinyección para avanzar los estudios en la curación de heridas para la traducción en modelos de mamíferos.

Microinyección de Heridas Ensayo y<em&gt; In vivo</em&gt; Localización de la herida epidérmica Reporteros de respuesta en<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones.

Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.

En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

Este protocolo está diseñado para evaluar la viabilidad de Drosophila en cada etapa del desarrollo, desde el embrión hasta el adulto. El método se puede utilizar para determinar y comparar la viabilidad de diferentes genotipos o condiciones de crecimiento.

Un método directo y simple para evaluar la viabilidad de Drosophila melanogasterde Embryo a Adult

La integridad de la barrera hematoencefálica es fundamental para la función del sistema nervioso. En Drosophila melanogaster, la barrera hematoencefálica se forma por células gliales durante la embriogénesis tardía. Este protocolo describe los métodos para el ensayo para la formación y el mantenimiento de barreras hematoencefálicas en embriones D. melanogaster y larvas de tercera estrella.

Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster

En el presente protocolo, demostramos cómo visualizar la resección final de doble cadena de ADN durante la fase S / G2 del ciclo celular utilizando un método basado en inmunofluorescencia.

Evaluación de la resección final global de DOBLE cadena de ADN utilizando el etiquetado brdU-DNA junto con imágenes de discriminación del ciclo celular

Este protocolo describe un ensayo extracromosómico de unión de extremos no homólogos (NHEJ) y un ensayo de recombinación homóloga (HR) para cuantificar la eficiencia de NHEJ y HR en células HEK-293T.

Análisis de la unión de extremos no homólogos y la eficiencia de recombinación homóloga en células HEK-293T utilizando sistemas reporteros basados en GFP

Presentamos protocolos para la evaluación de la competencia de la vía de reparación de roturas de doble cadena en células utilizando un conjunto de sustratos reporteros extracromosómicos basados en luminiscencia.

Evaluación de la actividad de reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante ensayos reporteros cuantitativos y de alto rendimiento basados en luminiscencia

Aprende a medir la reparación de roturas de doble cadena del ADN mediante el ensayo DR-white en Drosophila melanogaster. Este protocolo permite distinguir entre recombinación homóloga, unión de extremos y annealing de hebra simple.

Medición de la reparación de roturas de doble cadena del ADN mediante el ensayo DR-white en Drosophila melanogaster

Explorar más videos