Separación electroforética de las proteínas

La separación de proteínas individuales a partir de mezclas complejas de proteínas puede lograrse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, conocida también como PAGE. Las proteínas migran en respuesta a un campo eléctrico a través de los poros de la matriz del gel. La combinación del tamaño de los poros del gel y la carga, tamaño y forma de la proteína determina la velocidad de migración de esta. En este video, demostraremos un método para la separación electroforética de proteínas.

Hola, soy el Dr. Bobul Chakravarti del Centro de Proteómica del Instituto Graduado Keck de Ciencias de la Vida Aplicadas. Hoy les mostraré un procedimiento para realizar electroforesis en gel 1D. Así que comencemos.

Para comenzar, ensamble el sándwich de placas de vidrio del aparato de electroforesis según las instrucciones del fabricante, utilizando dos placas de vidrio limpias y dos espaciadores de 1,5 milímetros. Ahora fije el sándwich de placas de vidrio al soporte de vertido. A continuación, prepare la solución del gel de separación que se ha descrito en los protocolos actuales.

Añada la cantidad especificada de sulfato de peramoniaco al 10% y TEMED a la solución y agite suavemente para mezclar. Debido a la alta concentración de acrilamida, no es necesario desgasificar. Utilizando una pipeta plástica desechable de 10 mililitros, aplique inmediatamente la solución del gel de separación al emparedado a lo largo de un borde de uno de los espaciadores hasta que la altura de la solución entre las placas de vidrio sea de aproximadamente 11 centímetros.

A continuación, utilice otra pipeta para cubrir lentamente la parte superior del gel con una capa de aproximadamente un centímetro de espesor de alcohol isobutílico saturado con agua o agua destilada. Haga esto superponiendo suavemente el agua contra el borde de uno y luego del otro de los espaciadores, y deje polimerizar el gel durante 30 a 60 minutos. A temperatura ambiente, la capa de agua asegura que el gel de acrilamida polimerice en una línea recta.

Una vez que el gel se polimeriza, estamos listos para verter el gel de concentración. Primero, vierta la capa de agua destilada, luego enjuague con tris CL 1x en SDS a un pH de 8.8. Ahora prepare la solución del gel de concentración según se indica en los protocolos actuales.

A continuación, utilizando una pipeta de plástico, deje que la solución del gel de concentración fluya lentamente hacia el centro del sándwich a lo largo de un borde de uno de los espaciadores hasta que la altura de la solución en el sándwich sea de aproximadamente un centímetro desde la parte superior de las placas. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en el gel de concentración. Una vez vertido el gel, inserte un peine de teflón de 0,75 milímetros en la capa de la solución del gel de concentración.

Deje que la solución del gel de apilamiento polimerice de 30 a 45 minutos a temperatura ambiente; ahora estamos listos para preparar las muestras de proteína. Para comenzar la preparación de las muestras de proteína, diluya una porción de la muestra de proteína que se va a analizar en una proporción uno a uno con tampón muestral 2X SDS.

Para soluciones de proteínas diluidas, considere usar una mezcla de proteína a tampón de muestra SDS en una proporción de cinco a uno. Si la muestra es un precipitado proteico en forma de pellet, disuelva la proteína en 50 a 100 microlitros de tampón de muestra SDS 1X. A continuación, caliente las muestras durante tres a cinco minutos a 100 grados Celsius en un tubo de microcentrífuga con tapa roscada sellada, dentro de un baño de agua.

A continuación, retire cuidadosamente el peine de teflón sin romper los bordes de los pocillos de poliacrilamida. Después de retirar el peine, enjuague los pocillos con tampón de electroforesis SDS 1X. Luego, utilizando una pipeta, llene los pocillos con tampón de electroforesis SDS 1X.

Una vez que se hayan enjuagado y llenado los pocillos con tampón, sujete el sándwich de gel a la cámara superior de tampón. Siguiendo las instrucciones del fabricante, llene la cámara inferior de tampón con la cantidad recomendada de tampón de electroforesis XSDS 1X. A continuación, coloque el sándwich sujeto a la cámara superior de tampón dentro de la cámara inferior de tampón.

Ahora llene completamente la cámara superior de tampón con tampón de electroforesis XSDS de modo que los pocillos de muestra del gel de apilado queden llenos de tampón. El gel ya está listo para cargarse; utilizando una pipeta automática de 25 o 100 microlitros con puntas para carga de geles, cargue la muestra proteica en uno o más pocillos aplicando cuidadosamente la muestra como una capa delgada en el fondo de los pocillos. Cargue los pocillos de control con patrones de peso molecular.

También agregue un volumen igual de tampón de muestra XSDS a cualquier pocillo vacío para evitar la difusión de las bandas adyacentes. Ahora estamos listos para comenzar la electroforesis en gel. Para correr el gel, conecte la fuente de alimentación a la cámara y ejecute a 30 miliamperios de corriente constante para un gel en placa de 1,5 milímetros de grosor.

Una vez que el colorante azul de mentol haya alcanzado la parte inferior del gel de separación, desconecte la fuente de alimentación. Ahora que la electroforesis ha finalizado, deseche el tampón de electroforesis y retire la cámara superior de tampón con el sándwich de gel adherido. Oriente el gel de manera que se conozca el orden de los pocillos de muestra.

Luego, retire el sándwich de la cámara de tampón superior y colóquelo sobre una hoja de papel absorbente o toallas de papel. A continuación, deslice cuidadosamente uno de los separadores a la mitad desde el borde del sándwich a lo largo de toda su longitud. Utilice el separador expuesto como palanca para abrir la placa de vidrio, exponiendo cuidadosamente el gel.

Retire el gel de la placa inferior. Corte un pequeño triángulo de una esquina del gel para que la orientación de las bandas no se pierda durante la tinción y el secado. El procedimiento de electroforesis en gel ahora está completo.

El gel ya puede procesarse utilizando diversos procedimientos de detección de proteínas. Acabamos de mostrarle cómo separar proteínas mediante electroforesis en gel. Eso es todo.

Gracias por ver el video y mucha suerte con su experimento.