Name: Electroporación de micobacterias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprende a transformar micobacterias mediante electroporación, un método eficaz para introducir ADN en células con paredes celulares resistentes. Este protocolo optimizado utiliza Mycobacterium smegmatis y ofrece eficiencias de transformación de 10⁵–10⁶ colonias/µg.

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electroporación de micobacterias

Electroporation of Mycobacteria

Transformación de alta eficiencia es una limitación importante en el estudio de las micobacterias. El género Mycobacterium pueden ser difíciles de transformar, lo que es causada principalmente por la pared celular gruesa y cerosa, pero se ve agravado por el hecho de que la mayoría de las técnicas moleculares han sido desarrollados para especies poco relacionadas, tales como Escherichia coli y Bacillus subtilis. A pesar de estos obstáculos, los plásmidos de micobacterias han sido identificados y la transformación del ADN de muchas especies de micobacterias han sido descritas. El método más exitoso para la introducción de ADN en las micobacterias es la electroporación. Muchos parámetros de contribuir a la transformación exitosa, que incluyen la especie / variedad, la naturaleza de la transformación de ADN, el marcador de selección utilizado, el medio de cultivo y las condiciones para el impulso de la electroporación. Métodos optimizados para la transformación tanto de lento y rápido cultivadores se detallan aquí. Eficiencia de transformación para las diferentes especies de micobacterias, y con varios marcadores de selección se informó.

Estrategias de micobacterias patógenas siguen siendo poco conocidos. El lento crecimiento de la mayoría de las especies, la naturaleza impenetrable de la pared celular, y los riesgos de trabajar con agentes patógenos que las micobacterias difíciles de estudiar y son en gran parte responsable de nuestro pobre entendimiento de estos organismos. En este video vamos a demostrar la técnica de la electroporación, que consiste en someter las células a un breve impulso eléctrico de alta para permitir la entrada de ADN. Es el método más ampliamente utilizado para la introducción de ADN en las células de la micobacteria.

Electroporación de micobacterias

La transformación de alta eficiencia representa una limitación importante en el estudio de las micobacterias. El género Mycobacterium puede ser difícil de transformar; esto se debe principalmente...

Las estrategias patógenas de las micobacterias siguen siendo poco comprendidas debido a la tasa de crecimiento lento de la mayoría de las especies. La naturaleza impermeable de la pared celular y los riesgos asociados con el trabajo con patógenos dificultan el estudio de las micobacterias y son en gran parte responsables de nuestro escaso conocimiento sobre estos organismos. En este video, demostraremos la técnica de electrotransformación, que consiste en someter a las células a un impulso eléctrico breve e intenso, lo que permite la entrada de ADN.Es el método más ampliamente utilizado para introducir ADN en células micobacterianas. Hola, soy Ron Good del laboratorio de Tanya Parish del Centro de Enfermedades Infecciosas en los Murciélagos y la Escuela de Medicina y Odontología de Londres. Hoy les mostraremos un procedimiento para electrotransformar micobacterias.En nuestro laboratorio, estudiamos Microbacterium tuberculosis, pero debido a que es altamente patógeno y requiere instalaciones de contención C3, les mostraremos esta técnica en Microbacterium smegmatis, que no es patógeno. Así que vamos a electrotransformar algunas bacterias. Para transformar micobacterias, necesitamos preparar células competentes.Es importante recordar que las micobacterias patógenas representan un riesgo biológico importante. Por lo tanto, todos los cultivos y manipulaciones genéticas deben realizarse en un confinamiento adecuado. Las instalaciones dentro de una cabina de seguridad de clase uno deben incluir una evaluación de riesgos que constituya la primera parte de cualquier experimento con micobacterias patógenas.Para elaborar estas preparaciones, comenzamos con el cultivo que se ha mantenido en el laboratorio en medios sólidos como lemko, inóculo auger, caldo Lemko al cinco por ciento conteniendo tween, inoculado con un asa llena de micobacterias. Dado que muchas micobacterias son organismos de crecimiento relativamente lento, es extremadamente importante mantener una buena técnica aséptica para prevenir la contaminación de estos cultivos con bacterias o hongos que puedan crecer rápidamente y desplazar a las micobacterias. A menudo es conveniente establecer cultivos duplicados por si uno de ellos se contamina.Las células de micobacterias tienden a agruparse en cultivo debido a su gruesa capa cerosa. La agitación por vortex y la adición de un detergente no iónico como el Tween 82 al medio reducen este agrupamiento y proporcionan una suspensión celular más homogénea. Después de la inoculación, incubar el cultivo a 37 grados Celsius con agitación a cien RPM durante la noche.Después de que el cultivo iniciador haya crecido, inocule un cultivo a gran escala con aproximadamente cien mililitros de lemko tw en un matraz cónico de 250 mililitros utilizando una dilución uno a 100 del cultivo nocturno. Continúe la incubación a 37 grados Celsius con agitación durante aproximadamente 16 a 24 horas, momento en el cual se puede verificar la densidad óptica mediante el espectrofotómetro. Si la lectura es de 0,8 a uno, las células se encuentran en su fase logarítmica de crecimiento óptima.Posteriormente, incube las células en hielo durante 1,5 horas antes de la recolección, lo que ayudará a aumentar la eficiencia de transformación en cuatro veces. Incubaciones más largas en hielo provocan una eficiencia reducida. A continuación, recolecte las células vertiendo los cultivos en tubos de centrifugación grandes.Centrifugar a 300 G durante 10 minutos; tras la centrifugación, lavar las células tres veces con glicerol al 10 % frío en hielo, reduciendo el volumen cada vez, de forma que para un volumen de cultivo de cien mililitros, se utilicen 20 mililitros en el primer lavado, luego 10 mililitros y finalmente 5 mililitros en el último lavado. Tras los lavados, resuspender las células en una proporción de uno a diez o uno a cien del volumen original en glicerol al 10 % frío en hielo. En este punto, las células pueden fraccionarse, congelarse y almacenarse a -70 °C para uso futuro.La eficiencia de transformación a menudo aumenta después de congelar las células. Antes de usar estas células competentes, se deben descongelar, recolectar mediante centrifugación y resuspender en glicerol fresco al 10 % antes de su uso. Con el fin de realizar la electrotransformación, se necesita un electro, que es un aparato capaz de entregar un impulso de alto voltaje de 2,5.Se utiliza kilovoltios. Las bacterias y el ADN se colocan en cubetas para electroforesis. Y aunque la separación o longitud del recorrido puede ser la misma en diferentes cubetas, estas varían con respecto al volumen que pueden contener.Utilizamos rutinariamente 200 microlitros de células en una cubeta de 0,2 centímetros para electrotransformar las células. Primero, prepare la muestra de ADN de manera que esté libre de sales y otros contaminantes. Esto es importante para minimizar las posibilidades de arco eléctrico durante la electrotransformación.Antes de verter las bacterias, asegúrese de que sus muestras de ADN sean de alta pureza. La relación de absorbancia entre 60 y 80 debe ser cercana a 1,8. Añada de 0,5 a cinco microgramos de ADN libre de sales, en un volumen no superior a cinco microlitros, a una suspensión microbacteriana de 200 microlitros. Se puede incluir una electrotransformación de control sin ADN para verificar la frecuencia de mutantes resistentes a antibióticos.Luego, deje la mezcla en hielo durante 10 minutos. Esto reducirá la presencia de células viables en la muestra y las sales en la solución de ADN, lo que minimizará el arqueo después de la incubación en hielo. Redistribuya completamente las células mediante una pipeta o vórtex antes del pulso de alto voltaje para resuspender las células y asegurar la mezcla del ADN. Cualquier agregación de las células provocará arqueo y reducirá la eficiencia de transformación.A continuación, transfiera la mezcla a una celda con electrodo de 0,2 centímetros previamente enfriada. Nuevamente, tenga cuidado de no introducir burbujas en la mezcla. También para reducir la formación de arcos eléctricos.Asegúrese de que el exterior del QVE esté completamente seco antes de colocarlo en la cámara de pulsos. Después de secar minuciosamente el QVE y con la resistencia del controlador de pulsos ajustada a mil ohmios, coloque el QVE en la cámara de electro poración. Luego, tras establecer el voltaje en 2,5 kilovoltios, aplique el pulso hasta que se escuche un pitido, lo que indica que el capacitor del QVE se ha descargado.Una constante de tiempo mayor a 10 indicará una electroforesis exitosa. La electroforesis fallida suele indicarse mediante arcos eléctricos, que provocan una chispa, lo cual a menudo puede evitarse. Al modificar la resistencia en el controlador de impulsos, coloque nuevamente el Q vet en hielo durante 10 minutos.Después de la incubación, transfiera la suspensión celular a un frasco universal estéril que contenga cinco mililitros de caldo lemko TW. Es importante diluir las células al menos diez veces inmediatamente después del pulso para ayudar a su recuperación y aumentar la supervivencia de los transformantes. A continuación, incube las células a 37 grados Celsius durante dos o tres horas; luego de la incubación, estén listas para ser sembradas, recolecte las células por centrifugación a 3000 G durante 10 minutos.Tras la centrifugación, realice una dilución adecuada de la suspensión en caldo lemko de manera que cada placa reciba entre 30 y 300 colonias. Es importante asegurarse de que las colonias resistentes provengan de una sola célula; por ello, asegúrese de que las células se resuspendan completamente antes de sembrarlas. Si las células no se diluyen, puede ser muy difícil visualizar colonias verdaderamente resistentes frente a un césped de células sensibles. A continuación, siembre las células en agar lemko con el antibiótico adecuado.Incuban las placas a 37 grados Celsius hasta que las colonias sean visibles. Esto tomará de tres a cinco días después de que las colonias hayan crecido. Cuente los transformantes.Para calcular la eficiencia de transformación. Varios factores afectan la eficiencia de la transformación. Estos incluyen la fase de crecimiento de las células en el momento de la cosecha, el medio de electrotransformación y la intensidad del campo y la constante de tiempo del impulso aplicado.La eficiencia de la técnica de electrotransformación también depende de la elección del ADN para la transformación y, a veces, de la elección del marcador seleccionable. Habitualmente obtenemos eficiencias de 10 a la quinta a 10 a la sexta colonias por microgramo de ADN, utilizando resistencia a higromicina o estreptomicina en ems magma. Ahora, para hacer crecer los transformantes, realice un estrago de las micobacterias electrotransformadas sobre medio sólido más el agente de selección.Incubar con antibiótico a 37 grados durante dos o tres días. Tras la incubación de dos a tres días, se pueden analizar los transformantes según sea necesario para la mayoría de las aplicaciones; se deben sembrar por estría y analizar tres transformantes. Es importante verificar la identidad del plásmido extracromosómico tras la transformación.Dado que las eliminaciones y reordenamientos son comunes, acabo de mostrarle cómo electrolizar Mycobacterium s magma. Si va a realizar este procedimiento con microbacterias patógenas, recuerde utilizar las medidas de seguridad adecuadas. Eso es todo.Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.

Research

Investigación

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Biology

Biología

Fuente: Stefan, A., et al., Los beneficios multifacéticos de la coexpresión de proteínas en Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el procedimiento para transformar Escherichia coli con un plásmido portador de un gen de resistencia a los antibióticos, incluida la preparación celular, la electroporación, la recuperación y la selección de transformadores.

Preparación y transformación de bacterias mediante electroporación de alto voltaje

La electroporación es un método comúnmente empleado para introducir el ADN en las bacterias en un proceso conocido como transformación. Los protocolos tradicionales para la preparación de células electrocompetentes son mucho tiempo y mano de obra intensiva. Este artículo describe un suplente, rápida, y eficiente método para la preparación de células electrocompetentes actualmente empleados por algunos laboratorios.

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

La electroporación se utilizó para insertar proteínas efectoras de virulencia bacteriana purificadas directamente en células eucariotas vivas. La localización de proteínas se monitorizó mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal. Este método permite estudiar el tráfico, la función y las interacciones proteína-proteína utilizando proteínas exógenas activas, evitando la necesidad de expresión heteróloga en células eucariotas.

La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

Este protocolo describe las técnicas de microfabricación necesarias para construir un dispositivo de electroporación microfluídica de laboratorio en un chip. La configuración experimental realiza transfecciones controladas a nivel de una sola célula en un flujo continuo y se puede extender a rendimientos más altos con control basado en la población. Se proporciona un análisis que muestra la capacidad de monitorear eléctricamente el grado de permeabilización de la membrana celular en tiempo real.

La fabricación y operación de un sistema de microelectroporación de flujo continuo con detección de permeabilización

Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

La electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético es un método viable para modular la expresión génica sin comprometer la contractilidad muscular en ratones.

Electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético del ratón

Este protocolo detalla el enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas nativas (mEVs) de cultivos axénicos de Mycobacterium smegmatis (Msm) y cómo se pueden diseñar y enriquecer msmEVs recombinantes que contienen mCherry (un reportero fluorescente rojo). Por último, se verifica el novedoso enfoque con el enriquecimiento de MsmEVs que contienen la proteína EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

Describimos un procedimiento sencillo para la complementación cromosómica de una sola copia de un gen de bomba de eflujo utilizando un sistema de expresión basado en mini-Tn7 en una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en eflujo modificada. Esta precisa herramienta genética permite controlar la expresión génica, lo cual es clave para la caracterización de las bombas de eflujo en patógenos multirresistentes.

Caracterización de sistemas de eflujo de múltiples fármacos en Acinetobacter baumannii utilizando una cepa bacteriana deficiente en eflujo y un sistema de expresión génica de copia única

Este protocolo describe el método CTAB para extraer ADN de alta calidad de micobacterias, superando los desafíos que plantean sus duras paredes celulares ricas en ácido micólico. El proceso implica digestión enzimática, lisis celular con CTAB y purificación del ADN mediante extracción orgánica y precipitación de etanol. Este método produce ADN adecuado para estudios moleculares y es fiable para la investigación micobacteriana.

Extracción de ácido desoxirribonucleico de genoma completo de especies de Mycobacterium mediante la técnica de bromuro de cetiltrimetilatonio

Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.

Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

Aprende a transformar micobacterias mediante electroporación, un método eficaz para introducir ADN en células con paredes celulares resistentes. Este protocolo optimizado utiliza Mycobacterium smegmatis y ofrece eficiencias de transformación de 10⁵–10⁶ colonias/µg.

Electroporación de micobacterias

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