Electroporación de micobacterias

Las estrategias patógenas de micobacterias siguen siendo poco conocidas, debido a la lenta tasa de crecimiento de la mayoría de las especies. La naturaleza impenetrable de la pared celular y los peligros de trabajar con patógenos hacen que las micobacterias sean difíciles de estudiar y son en gran parte responsables de nuestra escasa comprensión de estos organismos. En este vídeo, demostraremos la técnica de electroporación, que consiste en someter a las células a un breve y alto impulso eléctrico, que permite la entrada del ADN.

Es el método más utilizado para introducir ADN en células micobacterianas. Hola, soy Ron Good, del laboratorio de Tanya Parish, del Centro de Enfermedades Infecciosas de los Bats y de la Escuela de Medicina y Odontología de Londres. Hoy le mostraremos un procedimiento para la electro operación de microbacterias.

En nuestro laboratorio estudiamos la microbacteria tuberculosis, pero debido a que es altamente patógena y requiere una instalación de contención de C3, te mostraremos esta técnica en la microbacteria no patógena m Mcma. Así que vamos a electro comer algunas bacterias. Para comer micobacterias, necesitamos producir células competentes.

Es importante recordar que las micobacterias patógenas representan un riesgo biológico importante. Por lo tanto, todo cultivo y manipulación genética debe llevarse a cabo en una contención adecuada. Instalaciones dentro de un armario de seguridad de clase uno La evaluación de riesgos debe constituir la primera parte de cualquier experimento con micobacterias patógenas.

Para hacerlos, comenzamos con el cultivo que se ha mantenido en el laboratorio en medios sólidos como lemko, infín inoculado, cinco milésimas de pulgada de Lemko que contienen caldo tween con un circuito lleno de micobacterias. Dado que muchas micobacterias son organismos de crecimiento relativamente lento, es extremadamente importante mantener una buena técnica aséptica para evitar la contaminación de estos cultivos con bacterias o hongos que pueden superar rápidamente a las micobacterias. A menudo es aconsejable establecer cultivos duplicados en caso de que uno se contamine.

Las células de micobacterias tienden a agruparse en cultivo debido a su gruesa capa cerosa. El vórtice y la adición de detergente no iónico como el medio tween 82 reduce esta aglomeración y proporciona una suspensión más homogénea de las células. Después de la inoculación, incubar el cultivo a 37 grados centígrados con agitación a cien RPM durante la noche.

Después de que el cultivo iniciador haya crecido, inocule un cultivo a gran escala de aproximadamente cien milésimas de pulgada de lemko tw en un matraz cónico de 250 milésimas de pulgada con una dilución de uno a 100 del cultivo durante la noche. Continúe incubando a 37 grados centígrados con agitación durante aproximadamente 16 a 24 horas, momento en el que se puede verificar la densidad óptica con el espectrofotómetro. Si se lee 0,8 a uno, las células están en su fase logarítmica óptima de crecimiento.

Después, incube las células en hielo durante 1,5 horas antes de la cosecha, lo que ayudará a cuadruplicar la eficiencia de la transformación. Más tiempo. Las incubaciones en hielo dan como resultado una eficiencia reducida. A continuación, recoja las células vertiendo los cultivos en grandes tubos de centrifugación.

Gire a 300 g durante 10 minutos después de la centrifugación, lave las células tres veces con hielo, el glicerol al 10% reduce el volumen cada vez, de modo que para un volumen de cultivo de cien comidas, se usan 20 comidas para el primer lavado, luego 10 milésimas de pulgada y finalmente cinco milésimas de pulgada para el último lavado. Después de los lavados, resus suspender las celdas en una a 10 a una a cien del volumen original de hielo frío. 10%glicerol en esta etapa, las células pueden ser alícuotas, congeladas y almacenadas a menos 70 grados Celsius para su uso futuro.

La eficiencia de transformación a menudo aumenta después de congelar las células. Antes de usar estas células competentes, debe descongelarse, cosecharse por centrifugación y resuspenderse en glicerol fresco al 10% antes de su uso. Con el fin de electro desfile, ems mag an electro, que es un aparato que puede entregar un pulso de alto voltaje de 2.5.

Se utilizan kilovoltios. Las bacterias y el ADN se colocan en electroporación, cubetas. Y aunque el espacio o la longitud del recorrido pueden ser los mismos en diferentes cubetas, varían con respecto al volumen que pueden soportar.

Utilizamos rutinariamente 200 microlitros de células en un qve de 0,2 centímetros para comer las células. Primero, prepare la muestra de ADN de manera que esté libre de sales y otros contaminantes. Esto es importante para minimizar las posibilidades de formación de arcos durante la electroporación.

Antes de analizar las bacterias, asegúrese de que sus muestras de ADN sean de alta pureza. La proporción de absorbente de dos 60 a dos 80 debe estar cerca de 1,8. Agregue de 0,5 a cinco microgramos de ADN sin sal en un volumen de no más de cinco microlitros a una suspensión microbacteriana de 200 microlitros, Se puede incluir una electroporación de control sin ADN para verificar la frecuencia de mutantes de resistencia a antibióticos.

Luego deje la mezcla en hielo durante 10 minutos. Esto reducirá la presencia de células vivas en la muestra y sales en la solución de ADN, lo que minimizará la formación de arcos después de la incubación con hielo, redistribuirá las células completamente con una pipeta o vórtice antes del pulso de alto voltaje para resuspender las células y asegurar la mezcla del ADN. Cualquier aglomeración de las células provocará la formación de arcos y reducirá la eficiencia de la transformación.

A continuación, transfiera la mezcla a un electrodo preenfriado de 0,2 centímetros gab qve. Nuevamente, tenga cuidado de no introducir burbujas en la mezcla. También para reducir la formación de arcos.

Asegúrese de que el exterior del qve esté completamente seco antes de colocarlo en la cámara de pulsos. Después de secar completamente el qve y con la resistencia del controlador de pulso configurada en mil ohmios, coloque el qve en la cámara de electroporación. Luego, después de ajustar el voltaje a 2,5 kilovoltios, aplique el pulso hasta que se escuche un pitido, lo que indica que el condensador del QVE se ha descargado.

Una constante de tiempo superior a 10 indicará una electroporación exitosa. La electroporación fallida generalmente se indica mediante arcos, lo que causa una chispa, que a menudo se puede evitar. Al cambiar la resistencia en el controlador de pulso, vuelva a poner el Q vet en hielo durante 10 minutos.

Después de la incubación, transfiera la suspensión celular a una botella universal estéril que contenga cinco milésimas de pulgada de caldo lemko TW. Es importante diluir las células al menos diez veces inmediatamente después del pulso para ayudar a las células a recuperarse y aumentar la supervivencia de los transformantes. A continuación, incube las células a 37 grados centígrados durante dos o tres horas, y luego estén listas para ser sabadas después de la incubación, coseche las células por centrifugación a 3000 Gs durante 10 minutos.

Después de la centrifugación, diluya adecuadamente la suspensión en el caldo lemko de modo que cada placa obtenga de 30 a 300 colonias. Es importante asegurarse de que las colonias resistentes hayan surgido de una sola célula, por lo tanto, asegúrese de que las células se resuspendan completamente antes de la siembra. Si las células no se diluyen, puede ser muy difícil visualizar colonias verdaderamente resistentes en un contexto El césped de células sensibles ahora cubre las células en una barrena lemko con el antibiótico adecuado.

Incuban las placas a 37 grados centígrados hasta que las colonias se hacen visibles. Esto tomará de tres a cinco días después de que las colonias hayan crecido. Cuenta los transformantes.

Para calcular la eficiencia de la transformación. Varios factores afectan la eficiencia de la transformación. Estos incluyen la fase de crecimiento de las células cuando se cosechan los medios de electroporación, y la intensidad de campo y la constante de tiempo del pulso entregado.

La eficacia de la técnica de electroporación también depende de la elección del ADN para la transformación y, a veces, de la elección del marcador seleccionable. Rutinariamente obtenemos eficiencias de 10 a la quinta, a 10 a la sexta colonias por microgramo, ADN, utilizando la resistencia a la higromicina o a la estreptomicina en el magma ems. Ahora, para crecer, los transformadores rayan las micobacterias electroporadas en medio sólido más selección.

El antibiótico se incuba a 37 grados durante dos o tres días. Después de la incubación de dos a tres días, puede analizar los transformantes según sea necesario para la mayoría de las aplicaciones, se deben rayar y analizar tres transformadores. Es importante verificar la identidad del plásmido cromosómico adicional después de la transformación.

Dado que las deleciones y los reordenamientos son comunes, acabo de mostrarle cómo electrolizar el magma de mycobacterium s. Si vas a realizar este procedimiento con microbacterias patógenas, recuerda utilizar las medidas de seguridad adecuadas. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.