Ratón epidérmico de la cresta neural de células madre (EPI-NCSC) Culturas

Hola, soy Maya Sibu Bloom del Instituto de Genética Humana y del Instituto de Células Madre del Noreste de Inglaterra en la Universidad de Newcastle. Y esto es del Colegio Médico de Wisconsin. Hoy les mostraremos nuestro procedimiento para preparar Al Explantes de Folículos Viscos de ratones.

Los folículos pilosos son el tejido inicial para la preparación de cultivos de células madre neurales de cresta epidermal. Este procedimiento implica la disección del cojín del bigote y la microdisección de los folículos pilosos, seguida de la aislamiento de las BULs y su colocación en una placa de cultivo. Así que comencemos.

Este procedimiento comienza con la disección de la protuberancia de los folículos pilosos del bigote de ratón adulto. Normalmente utilizamos ratones de dos a seis meses de edad; sin embargo, los ratones más jóvenes tienden a producir un mayor número de células madre. Los animales se anestesian y se sumergen completamente en una mezcla uno a uno de Betadine y peróxido de hidrógeno durante aproximadamente tres minutos para desinfectarlos; posteriormente, se rocía todo el ratón, especialmente la región facial, con etanol al 75 % y se lleva al ratón al microscopio de disección.

En la cabina de flujo laminar, diseccionar cuidadosamente las almohadillas WHI, evitando cortar los bulbos pilosos, y colocarlas en solución salina balanceada en equilibrio a temperatura ambiente. Para disecar los folículos WHI, sostener la piel junto al folículo con pinzas y luego cortar alrededor del folículo con tijeras rectas. Cortar profundamente.

Para evitar lesionar los bulbos pilosos, levante el folículo del bigote fuera de la almohadilla de bigotes y colóquelo en una nueva placa. Con HBSS fresco, jale los folículos dentro de la misma placa. Fije un folículo piloso con tijeras afiladas y agujas sobre una placa de Petri de vidrio recubierta con malla de seda que contenga HBSS.

Lave el tejido adiposo suelto y el tejido dérmico con chorros de tampón hasta que el folículo del bigote esté limpio. Si es necesario, corte el nervio del folículo del bigote y elimine el tejido adherido raspando y realizando lavados repetidos con HBSS. Corte longitudinalmente el folículo visco con una microhoja.

Evite cortar demasiado profundamente, ya que esto lesionaría la protuberancia. Elimine cualquier sangre con lavados repetidos de HBSS hasta que desaparezca. La aparición de sangre es un buen indicador de que el corte fue lo suficientemente profundo.

A continuación, realice un corte transversal por encima del nivel del seno conal y posteriormente un segundo corte transversal a nivel del seno anular, muy cerca de la piel, dentro del fragmento aislado del folículo. Ahora podrá ver la protuberancia dentro de la cápsula. Mire, allí está.

Agarre un extremo de la cápsula con la pinza y retire la protuberancia. Ahora verá la cápsula vacía y el grupo aislado de protuberancias. Coloque las protuberancias aisladas en una placa de cultivo separada con HBSS a temperatura ambiente.

Asegúrese de que ningún otro tejido esté contaminando los bulbos agrupados. En este punto, los bulbos pueden cultivarse antes del cultivo en plantas de bulbo. Las placas de cultivo de 35 milímetros se recubren con colágeno colocando gotas de 50 microlitros de colágeno y 10 microlitros estériles.

Solución salina al 6% una al lado de la otra. Mezcle bien con una pipeta de cartel doblemente doblada y empuje hacia el borde de la placa de cultivo; incube durante la noche en un ambiente limpio, pero sin dejar secar. Utilizamos un desecador con una placa de agua en la parte inferior para este fin.

Al día siguiente, día del cultivo. Lave las placas con solución salina, preincube y enjuague las placas de cultivo recubiertas con colágeno durante aproximadamente tres horas. Con medio de cultivo en el incubador; el medio de cultivo consiste en 85% alpha MEM modificado, 10% suero bovino fetal y 5% extracto de embrión de pollo del día 11.

Después de la preincubación, retire el medio de cultivo de las placas y agregue varias BULs con la menor cantidad posible de medio. Elimine el exceso de medio de cultivo. Incube durante una hora en un incubador celular en atmósfera humedecida con 10% de oxígeno y 5% de CO2.

Después de una hora, agregue lentamente 1,5 mililitros de cultivo. Las plantas de tamaño medio CHE deben adherirse al sustrato de colágeno; reemplace el 50 % del medio de cultivo diariamente. Bien, ahora comencemos.

Y ahora, un vistazo a los cultivos. En un plazo de tres a cuatro días, células altamente migratorias emigrarán desde los cultivos en bloque. Obsérvese su morfología estrellada y la ausencia predominante de contactos entre células.

En los próximos días, más células emigrarán y las células emigradas proliferarán rápidamente, incluyendo células raras importantes con morfología aplanada, que a veces se vuelve evidente varios días después que las células de la cresta neural epidermal. A veces se observan células madre en estos cultivos. Estas células no son células madre de la cresta neural epidermal, sino que son más bien células madre epidermales putativas, menos móviles, o progenitores; los cultivos compuestos por estas células deben descartarse.

Acabamos de mostrarle cómo preparar cultivos de explantes bulbares que contienen células madre neurales epidérmicas. Debido a que las células neurales son muy migratorias, abandonarán el explante bulbar en el transcurso de tres a cuatro días. Después del explante, se retira el bulbo y permanece en la placa de cultivo una población pura de células neurales.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar desinfectar cuidadosamente al ratón para evitar contaminación. También es necesario cortar profundamente en el cojín del riesgo para no dañar los folículos pilosos. Con respecto a los cultivos, es fundamental diferenciar entre el sobrenadante migratorio, las células de cresta neural, y los queratinocitos no migratorios con forma de adoquines.

Así que eso es todo. Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.