Evolución molecular de la recombinasa Tre

Me llamo Frank Alz. Soy líder de grupo en el Instituto Maxx Plunk de Biología y Genética Celular de la Mácula en Dresde. Y voy a hablar ahora sobre nuestro trabajo para desarrollar recombinasas específicas de sitio para cirugía molecular.

Básicamente, como una herramienta para poder eliminar secuencias predefinidas del genoma, y más específicamente, para intentar erradicar las células infectadas por el VIH del virus. Es decir, eliminar el provirus del VIH del genoma de las células infectadas. Otra idea central es que adaptamos una herramienta genética ya bien establecida, concretamente la recombinasa Cre, para que se una, reconozca y utilice un sitio diana que definimos previamente.

Así que nos propusimos determinar si podríamos crear una recombinasa específica de un sitio que se una a una secuencia que ocurre naturalmente en el LTR de un virus del VIH. Y si fuéramos capaces de hacerlo, predeciríamos que debería ser posible excindir el provirus del genoma. Básicamente, el ciclo vital del virus pasa por una etapa en la que el virus se integra en las células y, mediante una transcripción inversa, genera una plantilla de ADN que está flanqueada por dos repeticiones terminales.

Se denominan repeticiones terminales largas o LTRs cortas. A continuación, esto se introduce en el núcleo e integra más o menos al azar en el genoma del huésped. Así, ahora se tiene la situación en la que existe un denominado provirus, que está integrado y flanqueado por dos repeticiones terminales largas, es decir, por dos LTRs.

El concepto ahora era que si podíamos crear una recombinasa que reconociera una secuencia presente en el LTR, deberíamos poder excindir el provirus en forma de ciclo del genoma del huésped y, por lo tanto, erradicar el virus de las células. Esa era la idea conceptual. Pues bien, la recombinasa es en realidad una proteína que se une al ADN y encuentra un sitio muy específico.

Por lo tanto, tiene un dominio de unión al ADN, que reconoce una secuencia determinada dentro del ADN. Y solo cuando encuentra esta secuencia exacta, la enzima se activa. No está activa sobre ninguna de las otras secuencias.

Los principios de la evolución molecular son básicamente conocidos por cualquiera, ya que no es otra cosa que la cría selectiva. Así, un principio de la evolución molecular consiste en introducir mutaciones y luego tener un proceso de selección en el que se selecciona una propiedad determinada. Es lo mismo que cuando se realiza la cría de plantas.

Sabes que deseas cierto tamaño o cierto color, y luego siempre seleccionas para la siguiente generación descendientes que posean ciertas características, y comienzas a cruzarlos entre sí. Es exactamente lo mismo que hacemos con las moléculas. Básicamente es todo lo mismo, pero a pequeña escala.

Entonces comenzamos con una enzima que tiene una actividad determinada, en nuestro caso la recombinasa CRE, y luego partimos de una proteína de tipo silvestre. A continuación, mutamos ligeramente el sitio al que se une esta recombinasa, pero aún así presenta una actividad muy, muy, muy baja. Luego introducimos mutaciones aleatorias en la enzima, en la recombinasa, y seleccionamos mutantes que ahora son capaces de unirse a este sitio mutado.

Una vez que tenemos esto, también podemos combinar los diferentes mutantes entre sí para finalmente obtener el producto definitivo que deseamos, de modo que la recombinasa reconozca la secuencia que definimos en el LTR. Así que comenzamos, como dije, con una biblioteca de mutagénesis aleatoria. Esto se realiza típicamente mediante PCR propensa a errores.

Por lo tanto, utilizamos condiciones de PCR que, por ejemplo, con una polimerasa propensa a errores, generan muchos errores. De este modo, generamos una biblioteca aleatoria que lleva mutaciones distribuidas por todo el lugar. También podemos usar una cepa mutadora, una cepa bacteriana mutadora, que introduce muchas mutaciones en ciertos transcritos.

Y estos se utilizan luego como material inicial. La otra tecnología que empleamos es, después de un tiempo, una reordenación del ADN. Esta es básicamente una técnica que permite combinar diferentes mutaciones beneficiosas, ya que realmente no se sabe cuál de las mutaciones es beneficiosa, pero se tendrán diferentes mutantes que presentan mutaciones distintas.

Entonces, se tiene un gen que presenta una mutación aquí, la cual es beneficiosa. Se tiene un segundo clon que presenta una mutación aquí, y para combinar ambas, ahora se realiza una fragmentación aleatoria de las diferentes piezas y luego se unen en una reacción de PCR para volver a ensamblar los productos. Y ahora se tendrá, con cierta frecuencia, una combinación de las dos, en la que parte del producto de recombinación está formada por este mutante y otra parte por aquel mutante.

Y luego, este sujeto aquí tendrá un efecto adicional que mejorará y permitirá, y usted será capaz de seleccionar mucho más rápido los candidatos que poseen las propiedades deseadas. Por lo tanto, establecería la definición en la que digo que la proteína tipo silvestre no tiene absolutamente ninguna actividad sobre un sitio determinado. Así, si tomamos por ejemplo nuestra secuencia que seleccionamos del LTR, del LTR del VIH, si probamos la recombinasa cre sobre la secuencia, no tendrá absolutamente ninguna actividad.

La recombinasa CRE no es capaz de recombinar el sitio, y por definición diría que se tiene una nueva recombinasa cuando se posee una enzima capaz de unirse y recombinar esta secuencia. No predefinimos cuántos ciclos íbamos a realizar, pero llevamos a cabo tantos ciclos como fueron necesarios hasta obtener una enzima con la actividad deseada. Así, comenzamos con mutaciones muy pequeñas en el sitio y luego empezamos a combinar las diferentes mutaciones entre sí.

Este fue uno de los pasos importantes por los que funcionaba este proceso. Así que pasamos por intermediarios y tuvimos que realizar muchos ciclos para encontrar una enzima que luego tuviera actividad suficiente para pasar al siguiente ciclo. Es muy similar a cualquier proceso de selección.

Usted establece una actividad determinada que desea, una característica específica que quiere, y luego comienza la cría. Y hasta que no tenga lo que quería, no ha llegado allí y debe realizar más generaciones. Eso es básicamente en qué consiste.

También debo mencionar que los 120 ciclos de evolución, o ciento veintiocho, para ser exactos, solo lograron identificar un paso intermedio en el que dijimos: "ahora podemos detenernos porque tenemos cierta actividad". Las recombinasas que tenemos en este momento aún son menos activas que la recombinasa CRE en su forma tipo silvestre. Por lo tanto, para obtener una recombinasa más activa, tendríamos que realizar más ciclos de evolución.

Por lo tanto, básicamente no termina donde estamos ahora en el proceso de evolución. No veo limitaciones técnicas. Es cuestionable hasta dónde se puede llevar esto.

Entonces, las secuencias LTR del lado L, es decir, la secuencia que se encuentra en el LTR HA, comparten un 50 % de similitud de secuencia con el lado P natural, el lado natural que el sitio de recombinación reconoce. Por lo tanto, surge la pregunta: ¿es posible avanzar aún más?, y aún no lo sabemos, pero el hecho de que solo tuviéramos un 50 % de similitud de secuencia con el sitio de tipo salvaje sugiere que se podría llevar esto aún más lejos. La recombinasa funciona bien en cultivos celulares humanos, aunque, como mencioné, no es tan activa como la recombinasa query en su sitio específico.

Por lo tanto, probablemente la estabilidad sea algo menor que la de la recombinasa de consulta, es decir, la enzima de tipo salvaje, y sería necesario realizar más selección y más ciclos de evolución para mejorar estas características en el futuro. Así, el primer paso consiste en mejorar el sitio, esta recombinasa específica, la recombinasa tres, hacerla más activa, y tal vez encontrar otros sitios que sean muy prominentes y que serían buenos blancos en un LTR, y hallar una recombinasa muy eficaz para este propósito. Luego, tendríamos que probar esta recombinasa en diferentes ensayos, primero nuevamente en células de cultivo tisular, pero posteriormente, de forma muy importante, en modelos animales.

Por lo tanto, tendríamos que verificar si esta recombinasa tiene algún efecto secundario indeseable en un organismo. Y luego, por supuesto, un aspecto muy desafiante consiste en desarrollar un buen sistema de entrega para esta recombinasa, lo cual no es trivial y representa por sí solo un área completa de investigación que desarrollar.

Era esencialmente un enfoque de terapia génica que tendríamos que adoptar. Bueno, creo que estamos viendo un cambio en la medicina hacia un enfoque cada vez más molecular. Y para esto, por supuesto, necesitamos herramientas que nos permitan trabajar a esa escala.

Y aquí es donde veo el futuro del proceso evolutivo. Por lo tanto, necesitamos crear enzimas personalizadas que actúen en un proceso que realmente deseamos poder utilizar; en el caso de la recombinasa, quizás se podría tomar esto como una analogía a una herramienta para un cirujano que necesita extirpar durante una operación algo que debe eliminar. Así, ahora necesitamos herramientas con las que un cirujano molecular pueda excindir de forma específica un fragmento determinado de ADN del genoma.

Y para esto, necesita las herramientas para poder hacerlo. De manera que la evolución molecular puede cumplir básicamente esta función. Existen muchas enzimas en la naturaleza que tienen propiedades muy deseables para poder llevarlo a cabo.

Y simplemente debemos adaptarlos según nuestras necesidades, para poder hacerlos útiles. Y creo que la evolución molecular puede desempeñar un papel muy importante aquí. En cuanto a cuáles son las limitaciones, es difícil decirlo en este momento porque la tecnología, este campo, todavía está en sus inicios.

Así que el tiempo dirá cuáles son las limitaciones. Estoy seguro de que habrá algunas, pero en este momento, creo que hay más oportunidades que limitaciones reales.