Evolución molecular de la recombinasa Tre

Mi nombre es Frank Alz. Soy líder de grupo en el Instituto Maxx Plunk de Biología y Genética de Células Maculares y Dresde. Y voy a hablar ahora de nuestro trabajo para desarrollar recombinasa específica para la cirugía molecular.

Básicamente como una herramienta para poder extirpar secuencias, secuencias predefinidas del genoma, y más concretamente tratando de erradicar las células infectadas por el VIH del virus. Así que, básicamente, para extirpar el provirus del VIH del genoma de las células infectadas. Otro concepto es que adaptamos una herramienta genética ya bien establecida, a saber, la recombinasa Cree para unirse y reconocer y, y, y usar un sitio objetivo que predefinimos.

Así que nos propusimos decir, ¿podemos hacer una recombinasa específica para el sitio, que se une a un sitio que se encuentra naturalmente en el LTR de un virus del VIH? Y si fuéramos capaces de hacer eso, predeciríamos que entonces debería ser posible extirpar el provirus del genoma. Básicamente, el ciclo de vida viral pasa por una etapa en la que, en la que el virus se integra en las células y luego se realizan a través de una transcripción inversa, se forma una plantilla de ADN, que está flanqueada por dos repeticiones terminales.

Se llaman repeticiones terminales largas o LTR cortas. Y esto luego se lleva al núcleo y se integra más o menos aleatoriamente en el genoma del genoma del huésped. Así que ahora se tiene la situación en la que se tiene un llamado provirus, que está integrado y está flanqueado por dos repeticiones terminales largas por dos LTR.

El concepto ahora era que si podíamos hacer una secuencia de reconocimiento de recombinasa que existe en el LT R, deberíamos ser capaces de extirpar el provirus como un ciclo del genoma del huésped y, por lo tanto, erradicar el virus de las células. Esa era la idea conceptual. Bueno, la recombinasa es en realidad una proteína de unión al ADN y encuentra un sitio muy específico.

Por lo tanto, tiene un dominio de unión al ADN, que reconoce una cierta secuencia dentro del ADN. Y solo cuando encuentra esta secuencia exacta, la enzima se activa. No está activo en ninguna de las otras secuencias.

Los principios de la evolución molecular son básicamente conocidos por, por, por cualquiera porque no es otra cosa que la cría. Así que un principio de la evolución molecular es que se introducen mutaciones y luego se tiene un proceso de selección y se selecciona una determinada propiedad. Es lo mismo que cuando se hace el fitomejoramiento.

Sabes que quieres un cierto, un cierto tamaño o un cierto color, y luego tomas siempre de nuevo para la próxima generación de progenie que tiene ciertas características y comienzas a criarlos entre sí. Eso es exactamente lo mismo que hacemos con las moléculas. Así que es básicamente todo, pero a pequeña escala.

Así que comenzamos con una enzima que tiene una cierta actividad en nuestro caso que es la recombinasa CRE, y luego comenzamos con una proteína de tipo salvaje. A continuación, mutamos ligeramente el sitio al que se une esta recombinasa, pero sigue teniendo una actividad muy, muy, muy baja. Luego introducimos mutaciones aleatorias en la enzima, en la recombinasa y seleccionamos los mutantes, que ahora son capaces de unirse a este sitio mutado.

Una vez que tenemos esto, también podemos combinar los diferentes mutantes juntos para finalmente llegar al producto final que queremos tener para que la recombinasa reconozca la secuencia que definimos en The LTR. Así que empezamos, como he dicho, con una biblioteca de mutágenos aleatoria. Por lo general, esto se hace mediante PCR propensa a errores.

Así que usamos condiciones de PCR, que ya sea la polimerasa, por ejemplo, comete muchos errores. Y de esta manera generamos una biblioteca aleatoria que lleva mutaciones por todos lados. También podemos usar una cepa mutadora, una cepa mutadora bacteriana, que induce muchas mutaciones en ciertas transcripciones.

Y estos se utilizan como material de partida. La otra tecnología que usamos es que después de un tiempo usamos un barajado de ADN. Básicamente, se trata de una tecnología que permite combinar diferentes mutaciones beneficiosas porque no se sabe realmente cuál de las mutaciones es beneficiosa, pero habrá diferentes mutantes que tienen diferentes mutaciones.

Así que tienes un gen que tiene una mutación aquí, que es beneficiosa. Tienes un segundo clon que tiene una mutación aquí, y para unir estos dos, ahora realizas una fragmentación aleatoria de las diferentes piezas y luego lo juntas en una reacción de PCR para volver a ensamblar los productos. Y ahora tendrás, a cierta frecuencia, una combinación de los dos en la que parte de la recombinación está hecha de este mutante y parte está hecha de este mutante.

Y luego este tipo de aquí tendrá un efecto adicional que mejorará y, y podrá, seleccionar mucho más rápido los candidatos que tienen las propiedades deseadas. Así que establecería la definición donde digo que la proteína de tipo salvaje no tiene absolutamente ninguna actividad en un sitio determinado. Entonces, si tomamos, por ejemplo, nuestra secuencia que seleccionamos de la LTR de la H-I-V-L-T-R, si intentamos cre recombinasa en la secuencia, no tendrá absolutamente ninguna actividad.

La recombinasa CRE no es capaz de recombinar el sitio y se tiene una nueva recombinasa por definición, yo diría, cuando entonces se tiene una, una, una enzima que es capaz de unirse y recombinar esta secuencia. No predefinimos cuántos ciclos íbamos a hacer, pero realizamos tantos ciclos como fueran necesarios hasta que tuvimos una enzima que tuviera la actividad que queríamos. Así que comenzamos con mutaciones muy pequeñas en el sitio y luego comenzamos a combinar las diferentes mutaciones.

Este fue uno de los pasos importantes por los que este proceso estaba funcionando. Así que pasamos por intermedios y tuvimos que pasar por tantos ciclos para encontrar una enzima, que luego es lo suficientemente activa como para pasar al siguiente ciclo. Es muy similar a cualquier proceso de cría.

Configuras una determinada actividad que quieres, una determinada característica que quieres, y luego comienzas a reproducir. Y hasta que no tienes lo que querías, no estás ahí y tienes que hacer más generaciones. Ahí es básicamente donde está.

También debería decir que los 120 ciclos de evolución o ciento veintiocho seis para ser exactos, solo para encontrar un, un paso intermedio donde dijimos, así que ahora podemos parar porque tenemos alguna actividad. Las recombinaciones que tenemos ahora mismo siguen siendo menos activas que la recombinasa CRE en su lado salvaje. Por lo tanto, para obtener una recombinasa más activa, tendríamos que hacer más ciclos de evolución.

Así que básicamente no termina donde estamos ahora mismo para el proceso de evolución. No veo ninguna limitación técnica. Es cuestionable hasta dónde se puede llevar esto.

Por lo tanto, el lado de las cerraduras LTR, por lo que la secuencia que se encuentra en la LTR HA comparte un 50% de similitud de secuencia con el lado P de las cerraduras naturales, el lado natural que reconoce la recombinación de carreras. Así que la pregunta es, ¿se puede un objetivo aún más allá, y aún no lo sabemos, pero el hecho de que solo tuviéramos fif tiene un 50% de similitud de secuencia con el sitio de tipo salvaje y sugiere que puede llevar esto aún más lejos. La recombinasa funciona bien en células de cultivo de tejidos humanos, aunque, como dije, no es tan activa como la recombinasa, está de lado.

Por lo tanto, probablemente la estabilidad es algo menor que la recombinasa, la enzima de tipo salvaje lo es, y sería necesaria una mayor selección y más ciclos de evolución para mejorar estas características en el futuro. Así que el primer paso es que mejoremos el sitio, esta recombinasa específica, las tres recombinasas, hacerla más activa, tal vez encontrar otros sitios que sean sitios muy prominentes que lo sean, que serían buenos objetivos en un LTR y encontrar una muy buena recombinasa para esto. Luego tendríamos que probar esta recombinasa en diferentes ensayos, primero, nuevamente en células de cultivo de tejidos, pero luego, lo que es muy importante, probar esta recombinasa en modelos animales.

Por lo tanto, tendríamos que comprobar si esta recombinasa tiene algún efecto secundario indeseable en un organismo. Y luego, por supuesto, un aspecto muy desafiante es desarrollar un buen sistema de administración de esta recombinasa, que no es trivial. Y es toda una área de investigación en sí misma para desarrollar.

Era básicamente un enfoque de terapia génica que tendríamos que adoptar. Bueno, creo que vemos un cambio en la medicina que se vuelve cada vez más molecular. Y para ello, por supuesto, necesitamos herramientas para poder trabajar a tal escala.

Y aquí es donde veo dónde está el futuro del proceso de evolución. Por lo tanto, necesitamos hacer enzimas hechas a medida que funcionen en un proceso que realmente nos gustaría poder usar en el caso de la recombinasa, tal vez se podría tomar esto como una analogía con una herramienta para un cirujano que necesita extirpar en una operación, algo que necesita extirpar. Así que aquí necesitamos herramientas en las que un cirujano molecular básicamente quiere extirpar específicamente una cierta pieza de ADN del genoma.

Y para ello, necesita las herramientas para poder hacerlo. Así que la evolución molecular puede cumplir básicamente esta función. Existen muchas enzimas en la naturaleza, que tienen propiedades muy deseables para poder hacer esto.

Y solo tenemos que hacerlos a la medida de las necesidades que necesitamos, para poder hacerlos útiles. Y creo que la evolución molecular puede jugar un papel muy importante aquí. Es difícil decir dónde están las limitaciones en este momento porque la tecnología, este campo, todavía está en pañales.

Así que el tiempo dirá dónde están las limitaciones. Estoy seguro de que habrá algunos, pero en este momento, creo que hay más oportunidades que limitaciones.