Entrevista: El VIH-1 La escisión del ADN proviral uso de una recombinasa evolucionado

Soy JohE Hvar y me dirijo al Departamento de Biología Celular y Biología, del Instituto HE Pet en Hamburgo, Alemania. El Instituto HE PET es un instituto de investigación básica centrado exclusivamente en virus patógenos humanos y, sí, en temas relacionados, diría yo. Nuestro departamento está principalmente interesado en investigar la regulación de la expresión génica del VIH y en la interacción, particularmente la interacción intracelular del VIH con componentes de la célula huésped.

Además, sobre la base de estos datos, intentamos desarrollar terapias experimentales nuevas y novedosas para la enfermedad por VIH. El problema con el VIH es que este es un retrovirus o lentivirus, y como todo retrovirus, el VIH integra, tras la infección de la célula huésped, el genoma viral en el genoma de la célula huésped. Hasta ahora, no se puede eliminar el provirus integrado.

Esto significa que, en términos de terapia, estamos hablando de una enfermedad crónica con un tratamiento de por vida y, básicamente, con todos los problemas asociados a terapias de larga duración, como efectos secundarios de los medicamentos, aparición de resistencias, entre otros. Pues bien, durante muchos años, en la investigación básica, conocemos unas enzimas denominadas recombinasas, que ocurren naturalmente en procesos de recombinación como en levaduras o en bacterias, por ejemplo. Estas recombinasas reconocen secuencias específicas de ADN y reorganizan genes y rearreglan el genoma, entre otras funciones.

Y particularmente, una recombinasa llamada recombinación decre se utiliza en investigación básica y la situ en investigación básica. Y CRE básicamente reconoce su secuencia específica. Y si tiene una secuencia ubicada entre dos sitios de reconocimiento, CRE es capaz de excindir la secuencia intermedia básicamente.

Entonces, la idea, ya desde hace 10 o 15 años, es por un lado erradicar el virus en medicina y, por otro lado, utilizar una recombinasa, como por ejemplo Cre, para excindir el provirus. El ADN, esto debería ser teóricamente posible porque tras la infección, el VIH transcribe inversamente su genoma de AR a ADN y, debido a este proceso de transcripción inversa, se generan unas secuencias denominadas repeticiones terminales largas (LTR), que marcan básicamente el extremo 5' o comienzo y el extremo 3', o final, del provirus integrado en el ADN. Así, en teoría, si se pudiera diseñar un sistema de recombinación triple que reconociera específicamente una secuencia en el LTR, la recombinasa atacaría esencialmente el extremo 5' y el extremo 3' del provirus integrado, excindiría el ADN y, de forma básica, erradicaría el virus de la célula infectada. Ahora bien, el problema con el VIH es que existen diferentes aislados, quizás incluso en una sola persona, en un solo paciente; sin embargo, particularmente según sabemos hasta ahora, la secuencia en el comienzo y en el final del virus, del genoma viral, es conservada.

Es decir, los LTR están más conservados que, por ejemplo, los genes del VIH. Por lo tanto, creo que existe una buena posibilidad de que podamos conformarnos con solo unos pocos números de recombinantes que básicamente reconozcan la gran mayoría de todos los aislamientos de VIH. Y si no, entonces básicamente tendremos que generar uno nuevo mediante evolución molecular, lo cual en el futuro podría ser semiautomatizado.

Y lo hará, el proceso será mucho más rápido que hacerlo en el laboratorio. En este punto entra en escena nuestro colega, el Dr. Frank del Instituto Max Plank. Básicamente, él es un experto en recombinasas y en todo lo relacionado con ellas.

Básicamente, lo que utilizó es lo que denominamos un método de evolución molecular. Sin embargo, el método se basa en la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Y toma el gen de la recombinasa que ocurre naturalmente, llamada combs, y establece una reacción de PCR o múltiples reacciones de PCR en condiciones que introducen de forma aleatoria mutaciones.

Y el truco consiste ahora en seleccionar las nuevas versiones de la recombinasa que han adquirido una capacidad o actividad nueva, es decir, reconocer secuencias específicas del VIH. Y realiza este proceso en ciclos reiterados. Él necesitó aproximadamente 120 o más de 120 ciclos para llevar a cabo este tipo de método de evolución molecular.

Cuando finalmente propuso este recombinante específico, ahora denominado tres para la recombinancia específica de LTR, con este nuevo recombinante que ahora reconoce específicamente secuencias de VIH. Así, el estudio inicial aquí fue que los experimentos con los recombinantes se realizaron en el Instituto HE PET de Hamburgo. Y lo que hicimos fue, en especial, introducir este recombinante mediante vectores, vectores génicos, en cultivos celulares humanos que habían sido infectados con un aislado clínico más o menos representativo del VIH-1.

Y con el tiempo, durante seis u ocho semanas, habíamos podido demostrar eso. Ahora bien, lo recombinante es cuantitativamente prometedor: integran el perfil del VIH AD, y básicamente toda la cultura queda curada al eliminar el VIH. Ciertamente existen numerosos problemas con esta tecnología.

Antes que nada, debemos asegurarnos de que la expresión de la recombinasa no esté causando efectos secundarios tóxicos. No, no esperamos esto porque para recombinaciones naturales como gre, existen los llamados animales transgénicos. Ellos expresan esta recombinación GRE y, bueno, existen algunos problemas, pero no demasiado significativos.

En este punto, puedo decirlo. Así que existe la esperanza de que no haya efectos secundarios tóxicos, pero nunca se sabe hasta que se realicen los experimentos. Además, existen también problemas que podrían hacer que nosotros, quizás, no reconozcamos todos los aislados clínicos con este método, de manera que podamos deshacernos del aislado dominante, el aislado de VIH en un paciente.

Pero seleccionaremos a partir de aislamientos menores, cada vez más pequeños, con el tiempo. Esto es algo que desconocemos, debemos realizar estos experimentos. Luego existe un gran problema con la entrega génica, con la tecnología de vectores.

Debemos utilizar los llamados vectores lentivirales o también vectores retrovirales para entregar el gen o el gen de la recombinasa. Entonces, ¿existen efectos secundarios? Los hay, ¿estos vectores provocan efectos tóxicos?

Estas son todas las preguntas que tenemos. Además, esperamos mejorar la actividad de los peines. Ellos, la recombinación está actuando más rápido de lo que la observamos actualmente, en un par de semanas, la actividad.

Entonces, estas son todas preguntas abiertas que debemos desarrollar en los próximos años. Y este es ahora ciertamente el problema, porque las recombinasas no están disponibles por vía oral. Por lo tanto, no habrá ninguna pastilla, ninguna pastilla de recombinasa simplemente así, y usted se deshaga del virus.

Entonces, aunque se trate de especulaciones sobre terapias futuras, debemos considerar enfoques de terapia génica. Quizás se podría concebir aislar las llamadas células madre hematopoyéticas o células CD34 positivas de la sangre de pacientes infectados por VIH. Luego, en el laboratorio, introduciríamos el gen para los peines en estas células del paciente.

Finalmente, volvemos a introducir, reinyectamos al paciente, reinfundimos las células del paciente, que ahora están genéticamente modificadas, de vuelta al mismo paciente. Lo que debería ocurrir es que, con el tiempo, el sistema inmunitario o el sistema hematopoyético del paciente se reconstituya al menos parcialmente con células que, al infectarse con el VIH, puedan eliminar el virus porque ahora expresan una recombinasa. De este modo, el efecto sería una disminución de la carga viral en el paciente, lo que sin duda mejoraría su calidad de vida.

También podemos esperar que el sistema inmunitario se esté reconstituyendo en estos pacientes, al menos parcialmente. De modo que ahora, la, la, la función, las células inmunitarias que son completamente funcionales, podrán esperablemente atacar las células infectadas restantes en estos pacientes. Si realmente podemos o no erradicar por completo el VIH de un paciente, no podemos determinarlo en este momento.