Name: 潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-18T23:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶ C. elegansを用いたドーパミン神経変性アッセイで、パーキンソン病の遺伝子スクリーニングと神経保護メカニズムを探索する方法。この技術は神経変性疾患の治療標的発見に貢献します。

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我々はすべてコールドウェル研究室のメンバーの協力精神を認識したい。ラボにおける運動障害の研究は、バッハマン-シュトラウスジストニア＆パーキンソン財団、米国パーキンソン財団、米国パーキンソン病協会、アラバマ州のパーキンソン病協会、パーキンソン病研究のためのマイケルJフォックス財団、および学部研究によってサポートされています

A.発現プラスミドの構築二つのプラスミドが必要です。興味と選択可能な形質転換マーカー（プラスミドマーカーは、研究コミュニティ内から通常使用可能ですが）などの第二の遺伝子の組織特異的発現のための1つを。 実験的なプラスミド<ol><li>興味の組織/細胞型において発現されるプロモーターを選択し、この場合は、DAトランスポーター（Pdat - 1）プロモーターが使用されます。この発現プラスミドは、組換えクローニングを1プロモーターの関心の下流の任意の遺伝子の挿入を可能にするインビトロジェンのゲートウェイシステムと互換性のあるデスティネーションベクター（PDEST - DAT - 1）として作成されました。 </li><li>目的の遺伝子のcDNAをPCRには、ゲートウェイATT B組換え配列を含むプライマーを用いて増幅される。増幅したcDNAは、最初のエントリのベクトルを作成するためにドナーベクターpDONR201に再結合し、大腸菌株DH5αに変換されます。成功した組換え体とDNAのミニプレップ分離の選択後、エントリーベクターは、発現プラスミドを作成するPDEST - DAT - 1デスティネーションベクターに再結合されています。組み換えクローン作成の詳細については、InvitrogenのGatewayのマニュアルから、またはコールドウェルらで用意されています。5。 </li></ol>プラスミド選択可能なマーカープラスミド形質転換マーカーは明らか組織における蛍光タンパク質の発現を駆動するプロモーターを持つベクトルで構成されています。この特定の手順では、UNC - 54プロモーターは、体壁筋の桜のタンパク質発現（：：チェリーPunc - 54）を駆動します。 マイクロインジェクションを介してトランスジェニック線虫のB.の生成 ：関連Joveの記事を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833">https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833を</a> DAの神経変性の解析のためのC.遺伝子交雑<ol><li>ワームは、標準的な手順6を使用して栽培されています。 </li><li>プレイス10 Pdat - 1：：α- SYN、Pdat - 1：：（：：遺伝子XとPunc - 54：：チェリーPdat - 1を発現する）3-4 L4ステージトランスジェニック雌雄同体と交配プレート上にGFPの雄1、2 。これは、作成した3つの別々の安定した線のそれぞれに対して個別に実行する必要があります。 2日後、男性を取り外します。 </li><li> F1世代を点検し、いくつかの男性の子孫が存在する場合、交配が成功しました。 </li><li>それぞれのクロスから5両性L4動物をクローニングすること展示の両方Pdat - 1：：GFP蛍光マーカー（男性の親から継承されます）とPunc - 54：：チェリー蛍光体壁筋のマーカー（両性の親から継承されます）。クローン動物は、彼らはまだプレート上に存在する雄動物と交配されていないことを確認するためにL4段階にあるとする必要があります。それらが自己交差してF2子孫を生成することができます。 </li><li>ステップ3で生成したF2動物が出クローン化されています。具体的には、転送〜自分の個々のプレートに、両方の蛍光マーカーを示す50〜10の動物。画面DAニューロンの動物の100％がGFPを発現するプレートのF3世代や動物の一部が体壁筋細胞で発現する桜です。これらの動物はPdat - 1のホモ接合になります：：α- SYN、Pdat - 1：：GFP遺伝子を安定新しく作成された遺伝子（遺伝子X）を送信中。 </li></ol> D.ドーパミン作動性ニューロンの解析<ol><li>新鮮な上記で作成した3行のそれぞれのプレートだけでなく、Pdat - 1を準備します：：α- SYN、Pdat - 1：：GFP単独系統。彼らが大人に成長することができます。 </li><li>新鮮なプレート上にそれぞれのラインから30〜40トランスジェニック大人を転送する。それらを20℃で4時間胚を築くために許可する</li><li>大人を削除します。彼らはL4段階に到達するまでの胚は20℃で3〜4日間、開発することができます。 </li><li> 0.04 mg / mlの5 - フルオロ-2&#39; - デオキシウリジン（FUDR）を含むプレートに〜100トランスジェニックL4動物を選択してください。したがって、実験動物7を圧倒から子孫を防ぐDNA合成の阻害を介して次の世代のこのヌクレオチドアナログブロックの開発、。それは光に敏感であるため、光からFUDR板を保護する。 </li><li>成体動物は、産卵に続く様々な日で分析されます。分析の適切な日々は経験的に決定されています。例えば、我々は決定したその77％、87％、Pdat - 1の90％：：α- SYN、Pdat - 1：：GFPの動物はそれぞれ、日6、7および10後の開発で縮退DAニューロンを示す。したがって、我々が関心の導入遺伝子は神経変性を高める可能性があることを予測した場合、我々は6日目及び/または7で分析を行います。同様に、神経変性を抑制する可能性導入遺伝子は、7日目および10で分析されます。 </li><li> 4新鮮なアガロースパッドを（マイクロインジェクション寒天パッドとは異なり、これらの新鮮な使用されていると乾きが許可されていない）ことを確認します。それらの間でテープの部分を持つ2つの顕微鏡スライドを設定し、テープには、等価的に厚いパッドのためのスペーサーとして機能します。三分の一をレイベンチでそれらの間にスライドさせて（それらは三遅れないように配置されています）。中央のスライド上に溶融アガロースの低下を置き、すぐに垂直に3つのすべてのスライドにし、全体で、アガロースの上に別のスライドを置く。パッドの使用準備が整うまで、一緒に2つのスライドを残して、いくつかの追加のパッドを作る。 </li><li>ワームDAニューロンを分析するために、22 × 30mmのカバーガラス上の3 mMのレバミゾール（麻酔）の6μlのドロップを置きます。アガロースのパッド上にカバーガラスを反転して、ドロップに（10が30を超えて余分な得点する）40大人の動物を選んでください。他の行のそれぞれに対して繰り返します。 </li><li>落射蛍光及びFITCやGFPの可視化を可能にするフィルタキューブを持つ化合物の顕微鏡を使用して各CEPとADEニューロンの存在のためのスコアラインあたり30匹を。我々は、GFP HYQフィルターキューブ（クロマテクノロジー）を与える使用してください。添付のスコアリングシート上のデータを記録する。野生型の動物は、すべての4 CEPと2 ADEニューロンにおける完全なGFPの蛍光を保持します。 DAニューロンの喪失を示す個々の動物は、非WTまたは&quot;退化&quot;と記録されています。同様に、変性の程度は、各動物に失わ合計ニューロンと同様に人口を数えることによって得点することができます。 </li><li>分析を2回以上（試験ごとにラインごとに30以上の動物）を繰り返します。分析の三回から、野生型DAニューロンを示すワームの合計数が平均化されます。神経保護のための統計分析は、コントロールのワーム（：：α- SYN、Pdat - 1：Pdat - 1：GFP）を比較するために、学生のt -検定（P &lt;0.05）を用いて行われる株とそのDAニューロンで過剰発現する候補遺伝子。 </li></ol>

<ol><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis-based+RNAi+screening+identifies+neuroprotective+genes+in+a+Parkinson%E2%80%99s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model.</a> PNAS. 105, 728-733 (2008).</li>
<li>Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-synuclein+blocks+ER-golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> PNAS. 105, 145-150 (2008).</li>
<li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Genomics%3A+A+Discovery-Based+Laboratory+Course%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course.</a> , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).</li>
</ol>

ドーパミンニューロンの年齢に依存する損失は、パーキンソン病の臨床的特徴であり、α-シヌクレインと呼ばれる蛋白質の蓄積や折り畳みに関連付けられている。ここでは、Cのドーパミン作動性ニューロン、蛍光遺伝子を経由して、ラベルの作成 ​​方法を示しています虫とこれらの細胞で共発現ヒトα-シヌクレインによるパーキンソン病に見られる神経変性を模倣する。 このビデオでは、成長、遺伝学的交差、マウンティング、そしてどちらかの神経変性を高めたり、老化の過程で神経保護を提供する遺伝的要因を評価するためのトランスジェニック線虫のスコアリングのための方法論を示しています。ケアは、適切にニューロンの損失または保護の得点で男性との成功の遺伝的交雑を確保するために雌雄同体上演、および一貫性遺伝子のメンテナンスのためのマーカーを使用して取得されます。このように、C.虫はどちら神経変性に寄与するまたは向上させるニューロンの生存のための治療標的を表すことができる遺伝的要因の迅速な評価を容易にする。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>超純水</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>プレーン、3x1&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549</td><td></td></tr><tr><td>蛍光解剖用</td><td>顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>解剖用</td><td>顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>エピ蛍光</td><td>顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>Model E-800</td><td></td></tr><tr><td>フィルターキューブ、GFP HYQ</td><td>Endow Bandpass</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

パーキンソン病（PD）の診断と治療の改善が危険にさらされる人口をレンダリング感受性要因に関する知識に依存しています。 PDに関連する新たな遺伝的要因を識別しようとする過程で、科学者は候補遺伝子、多型、および重要な進歩を表すタンパク質の多くのリストを生成しているが、これらのリード線は、機構的に未定義のまま。私たちの仕事は大幅に単純な動物モデルシステムの利点を活用することによってこのようなリストを狭めることに狙いを定めています。人間は神経細胞の十億を有しているが、顕微鏡回虫線虫Caenorhabditis elegansは、正確に302 hemaphroditesでのわずか8農産物のドーパミン（DA）があります。投与量と年齢に依存する神経変性におけるC. elegansのDAニューロンの結果でPD -関連タンパク質、α-シヌクレインをコードするヒト遺伝子の発現。 DAニューロンのヒトα-シヌクレインを発現しているワームは同質であり、DAトランスポーターのプロモーター下にGFPとα-シヌクレインのヒト（Pdat - 1）の両方を表現する。 GFPの存在は、これらの動物ではDA神経変性を以下のための容易に視覚化マーカーとして機能します。我々は最初にα-シヌクレイン誘発性のDA神経変性がtorsinA、分子シャペロン活性が1の蛋白質によってこれらの動物で救助できることを実証した。さらに、候補PD関連遺伝子は、C. elegansのDAニューロンで過剰発現されたα-シヌクレインのミスフォールディングのアッセイを用いて大規模なRNAiスクリーニングの取り組みを経由して私たちの研究室で同定した。我々は、彼らがα-シヌクレイン誘発性のDA神経変性2を救出したとして7遺伝子の5人がPDの表現の重要な候補モジュレーターをテストしたことが判明。また、リンドクイストラボ（Joveのこの問題は）酵母の画面を実行したことにより、α-シヌクレイン依存毒性は細胞毒性を増強または抑制することができる遺伝子の読み出しとして使用されます。私たちは、その後、私たちの線虫α-シヌクレイン誘発神経変性のアッセイで酵母の候補遺伝子を調べ、正常にこれらの目標3、4の多くの検証。 私たちの方法論はPdat - 1プロモーターの制御下に候補遺伝子のcDNAの組換えクローニングを使用して、C. elegansのDAニューロン特異的発現ベクターの生成を伴います。これらのプラスミドは、成功した変換のための選択マーカーと共に、野生型（N2）ワームにマイクロインジェクションされています。 DAニューロンの候補タンパク質を生産する複数の安定したトランスジェニック系統が得られ、その後独立してα-シヌクレインの変性株に交差させ、老化の過程で、動物と個々のニューロンレベルの両方で、神経変性について評価されています。

このビデオでは、パーキンソン病のモデルとしてドーパミン作動性ニューロンの神経変性を評価するために線虫を使用する方法を示します。さらに、遺伝子スクリーニングは、どちら変性を高めたり、神経保護の要因を識別するために使用されます。

パーキンソン病（PD）の診断と治療の向上は、集団を...の状態にする感受性因子に関する知見に依存しています。

Caldwellラボ（別名：Worm Shack）では、C. elegansにおける神経疾患のメカニズムを研究しています。そして、実りある実験に明け暮れた一日の終わりには、レクリエーション活動で自分たちにご褒美を与えます。こんにちは。私はアラバマ大学生物科学科のCaldwell研究室に所属する学部生のAdam Knightです。本日は、C. elegansを用いたドパミン神経変性アッセイの実施方法を解説します。ドパミン神経変性虫株と、疾患関連候補遺伝子およびドパミン神経を過剰発現するトランスジェニック株を交配させます。こんにちは、Caldwell研究室の大学院生、Adam Harringtonです。今日は、ドーパミン作動性ニューロン解析のためのトランスジェニック線虫の準備方法について説明します。大学院生のShu Amichiです。ここでは、C. elegansのCEPおよびADEと呼ばれるドーパミン作動性ニューロンをアッセイする方法を紹介します。一般的に、ドーパミン作動性ニューロンにおいてGFPのみを発現している線虫では、細胞死は見られません。しかし、CLEが存在すると、細胞死および加齢に伴う神経変性が観察されます。このアッセイを用いることで、ドーパミン作動性ニューロンに別のトランスジェンを共発現させ、それがCLE誘発性の毒性を増強するか、あるいは抑制するかを判定することが可能です。それでは、始めていきましょう。ドーパミン作動性ニューロンの解析を行う前に、まず適切なGaN系統を交配させる必要があります。ドーパミン作動性ニューロン特異的プロモーターdat-1の制御下でalphas nucleおよびGFPの両方を発現する8匹の虫を交配プレートに移します。次に、目的の候補遺伝子のドーパミン作動性ニューロン特異的発現と、選択マーカーであるDS red twoの体壁筋細胞での発現を示す、L4期のトランスジェニックなca雌2匹を加えます。各トランスジーン構築物について、3つの安定したトランスジェニック系統を作成している点に注意してください。したがって、この遺伝交雑は、作成された3つの独立した安定系統それぞれに対して個別に実施する必要があります。2日後、さらに2～3日経過したところで雄を取り除いて廃棄します。その後、F1世代を確認してください。オスの子孫が数匹得られ、交配は成功しました。次に、オス親から受け継いだGFP蛍光マーカーと、hamadi親から受け継いだDS red two蛍光体壁筋マーカーの両方を示す個体を、各交配からAphrodite L4の新しいプレートに5匹ずつ個別に移します。移した個体は、まだ成熟（M）していないことを確実にするため、L4段階である必要があります。オスをプレート上に配置した状態で、F2世代の子孫を得るために3〜4日間自然交配させます。次に、F2世代の子孫を回収します。具体的には、両方のセントマーカーを示す個体を5〜10匹選び、それぞれ個別のプレートに転移させます。次に、F3世代をスクリーニングし、すべての個体のドーパミン作動性ニューロンでGFPが発現しており、かつ一部の個体で体壁筋細胞にDsRed2蛍光マーカーが発現しているプレートを選出します。これらの個体は、α-synuclein遺伝子とGFP遺伝子のホモ接合体であり、新しく作成したトランスジェニック遺伝子を安定して伝達しています。スクリーニングが完了したら、ドーパミン作動性ニューロンの解析を行う準備が整います。ニューロン解析を開始するために、前段階で特定した3匹の個体を用いて新しいプレートを調製します。3つのトランスジェニック系統それぞれについてプレートを用意してください。さらに、コントロールとしてalpha-synuclein GFP単独株のプレートも用意し、線虫を成体まで成長させます。虫が成体になったら、各系統から30〜40匹の形質転換個体を新しいプレートに転移させます。20 °Cで5時間卵を産ませます。5時間後、個体を回収して廃棄します。成体を20 °Cで3〜4日間維持し、胚がL4ステージに達するまで発育させます。次に、0.04 mg/mLの5-fluoro-2'-deoxyuridineを含むプレートに、トランスジェニックのL4個体を約100匹ピックアップして移します。このヌクレオチドアナログは、DNA合成を阻害することで次世代の発生を抑制します。FDURプレートは光感受性があるため、プレートにカバーをかけ、全体を包んで遮光してください。線虫解析用のアガロースパッドを作成します。これらは新鮮な状態で使用し、乾燥させないようにします。テープを縦に貼った顕微鏡スライドガラスを2枚用意してください。このテープは、パッドの厚さを均一にするためのスペーサーとして機能します。それらの間に3枚目のスライドをベンチ上に置きます。これで、3枚が横に並んで配置されました。溶融したアガロースをスライドの中央に1滴滴下し、別のスライドをそれに垂直かつ3枚すべてのスライドにわたるように素早く上に重ねます。分析するサンプル数に合わせて、必要な数だけ同様にアガロースパッドを作成します。アガロースパッドの準備ができたら、22 × 30 mmのカバーガラス上に、3 mMの11-MEAおよび麻酔薬を6 µL滴下します。成体40匹を液滴に集め、カバーガラスを反転させてagrosパッド上に載せます。他の各系統についても同様に繰り返します。各系統につき30匹の個体を観察し、それぞれのCEPおよびDニューロンの有無をスコア付けします。FITCまたはGFPの可視化が可能なフィルターキューブを備えたエピ蛍光共焦点顕微鏡を用い、endo G-F-P-H-Y-Qフィルターキューブを使用してデータをスコアリングシートに記録します。野生型個体では、4つのCEPニューロンおよび2つのA DEニューロンすべてでGFPが完全に保持されています。Dニューロンの消失を示す個体は、既知の野生型または変性個体としてスコア付けされます。これらのニューロンは、LG（GFPの消失）として記録されます。同様に、動物ごとの総消失ニューロン数をカウントすることで、変性の程度をスコアリングできます。また、各系統につき1回あたりさらに30匹の動物を用いて、この解析をさらに2回繰り返します。3回の解析で野生型のドパミン作動性ニューロンを示した個体数の合計を平均します。次に、Studentのt検定を用い、P値0.05未満を基準として神経保護能の統計解析を行います。コントロール群の個体と、ドパミン作動性ニューロンで候補遺伝子を過剰発現させる系統を比較するため、産卵後のさまざまな日にかけてこの解析を実施し、適切な解析日を経験的に決定します。例えば、alpha CLEとGFPを共発現させた個体において、発生後6日目、7日目、および10日目に、それぞれ77%、87%、90%の個体でドーパミン神経細胞の変性が認められることが判明しています。したがって、目的の導入遺伝子が神経変性を促進すると予測される場合は6日目に解析を行います。同様に、神経変性を抑制すると考えられる導入遺伝子については、7日目および10日目に解析を行います。以上で、C. elegansを用いたドーパミン神経変性アッセイの実施方法について説明しました。この手順を行う際は、1つ目に、遺伝学的交雑の際の選別には適切なマーカーを使用すること、2つ目に、交雑には健康な雄およびL4期のハーミフロダイトを使用することを忘れないでください。次に、CEPニューロンとDEニューロンを注意深く、かつ一貫してスコアリングしてください。この手順により、$\alpha$-CLET誘発性神経変性を増強または抑制する可能性のある遺伝因子の迅速なアッセイが可能になります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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