La MODS método para el diagnóstico de la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente

Por cada tres personas en el mundo, una está infectada con tuberculosis. El diagnóstico de la tuberculosis activa previene nuevas infecciones porque los pacientes con tuberculosis activa infectarán a entre 10 y 15 personas más por año hasta el momento en que sean tratadas o mueran. Mods es un acrónimo que usamos para evitar tener que decir observación microscópica, ensayo de susceptibilidad a medicamentos, y la razón por la que se llama así se hará evidente a medida que se explique la metodología.

En el breve video, describiremos la metodología mods para el diagnóstico rápido y económico de la tuberculosis y la tuberculosis resistente a múltiples medicamentos. En el vídeo se expondrá la metodología paso a paso. Discutiremos las implicaciones de bioseguridad de trabajar con cultivo líquido, y también explicaremos algunos de los problemas importantes de aseguramiento de la calidad que se requieren para el uso de esta metodología.

El ensayo mods fue desarrollado en la Universidad de Kayana en Lima, Perú, en el laboratorio de Bob Gilman. Siguiendo las observaciones hechas inicialmente por cavi. LOOSE estaba tratando de identificar formas rápidas de detectar mycobacterium tuberculosis en cultivos utilizando indicadores colormétricos.

Pero señaló que la observación de esos cultivos bajo el microscopio reveló la presencia de crecimiento de microbacterias varios días antes de que los indicadores colormétricos cambiaran de color, y fue sobre la base de esa observación que se desarrolló el ensayo del MOD. El ensayo de MOD se desarrolló en un entorno de recursos limitados y está dirigido a entornos de recursos limitados, por lo tanto, poco menos de 3 por prueba para la detección de TB basada en cultivo líquido y la detección de resistencia a múltiples fármacos. Es extremadamente atractivo y, por primera vez, lleva ese tipo de capacidad de diagnóstico a lugares donde los recursos son limitados.

Por lo tanto, el ensayo de mods se basa en tres principios centrales. La primera es que Mycobacterium tuberculosis crece en medios líquidos mucho más rápidamente que en medios sólidos. Este es un hecho que se conoce desde hace muchos años.

La segunda es que si observamos esos medios líquidos bajo el microscopio, podemos detectar el crecimiento de myb tuberculosis mucho más rápidamente que esperar la aparición macroscópica de colonias en medios sólidos. Y, de hecho, ese crecimiento es completamente característico, de modo que podemos distinguir la M. tuberculosis en medios líquidos de la contaminación por bacterias o hongos, o incluso del crecimiento de micobacterias no tuberculosas atípicas que podrían estar presentes. Por último, y esto es quizás lo más emocionante del ensayo de mods, es que podemos incorporar los fármacos rifampicina y por tanto la resistencia a múltiples fármacos directamente desde el esputo.

Al usar esos medicamentos al comienzo del ensayo, podemos detectar tanto la tuberculosis como al mismo tiempo si el aislado es resistente o no a esos dos medicamentos. Y esto obvia la necesidad de subcultivar y crear una prueba indirecta de susceptibilidad a los medicamentos. Así que ahora solo vamos a describir el equipo que se requiere para hacer el ensayo de mods.

Se necesita una nevera para almacenar los medios preparados. Se requiere una balanza para pesar el is y la rifampicina. Se necesita un vórtice para mezclar el esputo.

Con la solución de descontaminación, se requiere una centrífuga para concentrar la muestra de esputo descontaminada, y esta debe ser capaz de alcanzar 3000 G. La centrífuga no necesita refrigerarse, pero es absolutamente esencial que sea bios segura y que sea bios segura. Para el trabajo con micobacterias, eso requiere que los cubos de la centrífuga se puedan sellar con tapas con cerradura. Se requiere una incubadora que pueda alcanzar 37 y mantener 37 grados centígrados.

No es necesario que esté enriquecido con CO2. Se requiere un microscopio invertido para leer las placas de los mods, y este debe tener objetivos de cuatro x y 10 x y se necesita autoclave para esterilizar los medios y también para la eliminación del cultivo de microbacterias, se requieren micros de desechos para alícuotas en los medios, un gabinete de seguridad biológica. La clase dos es necesaria para los procedimientos que implican la manipulación de muestras de esputo y la inoculación de placas.

Los reactivos necesarios para realizar el ensayo de mods son los siguientes, Middlebrook seven H nine media cascione y glycerol Panta, que es el suplemento antibiótico y OADC. Las existencias de suplementos nutricionales de los antibióticos son y dimetilsulfóxido de rifampicina, DMSO para la preparación de rifampicina, hidróxido de sodio, citrato de sodio y cisteína de nyl para la descontaminación de esputo di, fosfato de sodio y fosfato monopotásico para la preparación del tampón de fosfato, hipoclorito de sodio al 10% para la eliminación de residuos infectados y desinfectante para la limpieza de superficies de trabajo. También se requieren los siguientes plásticos y consumibles: tubos de vidrio estériles, filtros de 0,2 micrómetros para solventes acuosos y filtros de 0,2 micrómetros para solventes orgánicos, tubos de microcentrífuga, tubos de centrífuga de 15 milésimas de pulgada, estériles de 50 mililitros, 10 mililitros de pepppes pasados, puntas de micropipetas estériles, placas de tipo cultivo de tejidos de 24 pocillos y bolsas de ine tipo Ziploc sellables que son las placas de 24 pocillos que se colocan después de que la muestra de esputo se inocula en el medio.

Hay cuatro grupos de soluciones de stock que se pueden preparar con anticipación. La solución tampón de fosfato está hecha de una combinación de soluciones monobásicas de fosfato de sodio, diba y fosfato de potasio ajustadas a un pH de 6,8 más o menos 0,2. Esta solución se esteriliza en autoclave a 121 a 124 grados centígrados durante 15 minutos para esterilizar, y se cultiva una alícuota en agar nutriente para confirmar la esterilidad.

Esto se puede almacenar en el refrigerador a dos a ocho grados centígrados hasta por un mes. Cada muestra de esputo requiere 10 mililitros de solución tampón de fosfato. La solución madre para la descontaminación del esputo es una combinación de hidróxido de sodio y citrato de sodio.

Estas soluciones se combinan en volúmenes iguales y se esterilizan en autoclave de 121 a 124 grados centígrados durante 15 minutos y también se pueden almacenar en el refrigerador a dos a ocho grados centígrados hasta por un mes. Se requieren dos mililitros de esta solución para cada muestra de esputo. El medio de cultivo básico está compuesto por Middlebrook seven H nine con cascione y glicerol.

El polvo de siete H nine se disuelve en agua destilada estéril que contiene glicerol y cascione y se mezcla con agitación constante hasta que se disuelve por completo. Este medio se esteriliza en autoclave a 121 a 124 grados centígrados durante 15 minutos, y después del enfriamiento se divide en cuartos de 4,5 mililitros en tubos de vidrio estériles de 16 por 100 milímetros. El medio se incuba a 37 grados durante 48 horas para verificar la esterilidad, que se indica por la falta de turbidez después de este tiempo y puede almacenarse de dos a ocho grados centígrados con la tapa bien cerrada hasta por un mes.

Cada muestra de esputo requiere un tubo que contenga 4,5 mililitros de este cultivo. Las soluciones madre antibióticas medianas se preparan de la siguiente manera, se disuelven completamente en agua destilada estéril y se filtran con un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros para disolventes acuosos. A continuación, se pueden almacenar 20 alícuotas de microlitros en tubos de microcentrifugación estériles a menos 20 grados centígrados durante un máximo de seis meses; cada alícuota de 20 microlitros es suficiente para hasta cien muestras.

Las soluciones madre de rifampicina de ocho miligramos por mil, se preparan disolviendo rifampicina en DMSO y agua destilada estéril. Esta mezcla se filtra con un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros para disolventes orgánicos, y la solución puede almacenarse en alícuotas de 20 microlitros en tubos de microcentrífuga estériles a menos 20 grados centígrados durante un máximo de seis meses, cada alícuota de 20 microlitros es suficiente para hasta 100 muestras. Así que ahora llegamos a la parte de la metodología en sí y los tres pasos que debe realizar el día del procedimiento.

Esto está convirtiendo las soluciones de stock en soluciones de trabajo. Primero tenemos la solución de descontaminación, luego tenemos la solución de medios. Y finalmente, las soluciones de trabajo de los medicamentos isen y rifampicina.

El método de descontaminación, que se utiliza para la metodología mods, es la metodología estandarizada de descontaminación de hidróxido de sodio nalk. El nalk es un mucolítico, que ayuda a digerir el esputo y permitir que el hidróxido de sodio haga la descontaminación. Para ello, necesitamos nuestra solución madre de hidróxido de sodio y citrato sódico y se añaden 0,1 gramos de NA a 20 ml de esa solución.

Cualquier solución que no se utilice el día de la preparación debe desecharse. La preparación final del medio de cultivo también debe realizarse solo el día de su uso. Los siete medios H nine almacenados se combinan con OADC y panta, 4,5 mililitros del medio se combinan con 0,5 mililitros de OADC y 0,1 mililitros de Panta en cada tubo.

Esto es suficiente para una muestra. Las soluciones de trabajo de cada medicamento se preparan el día de su uso, y las soluciones que no se utilizan deben descartarse porque no se puede garantizar la actividad, las alícuotas almacenadas se diluyen en 24. Placas de cultivo de tejidos de pocillos en serie con medios siete H nine oh A DC de tal manera que la concentración final del pocillo que se logra después de que se ha agregado la muestra de esputo con el medio es de 0,4 microgramos por mil, ácido forico y un microgramo por mil, para rifampicina.

Ahora al procedimiento de descontaminación, se colocan dos milésimas de pulgada de muestra de esputo en un tubo Falcon cónico y luego se agregan dos milésimas de pulgada de nuestra solución de descontaminación de leche de hidróxido de sodio. La tapa se vuelve a colocar y se atornilla herméticamente, después de lo cual la suspensión se agita y se deja reposar durante 15 minutos, tiempo durante el cual se lleva a cabo el procedimiento de descontaminación. Pasado este tiempo, se añaden 14 mililitros de solución tampón de fosfato.

Se vuelve a colocar la tapa y se atornilla herméticamente, y el tubo se coloca en la centrífuga después de 50 minutos a 3000 G, se decanta el sobrenadante S y el pellet que queda es la muestra que deseamos colocar utilizando los tubos de 5,1 mililitros de siete H nine OEDC panter. Nuestro pellet se resuspende a un volumen de aproximadamente dos mililitros. La mitad de esta muestra resuspendida se almacena como respaldo en un tubo de microcentrífuga.

Esto está disponible en caso de que nuestro cultivo se contamine y necesitemos volver a colocar la muestra. El otro mililitro se añade a los siete H nine oh a DC restantes que están en nuestro tubo de vidrio, y esta es nuestra muestra que está lista para ser emplatada. Se colocan 900 microlitros de esta suspensión de medio y muestra en cada uno de los cuatro pocillos en una columna de una placa de 24 pocillos.

Los pocillos restantes de la placa de 24 pocillos se llenan con muestras subsiguientes, de modo que cinco muestras llenan una placa de 24 pocillos, una para cada una de las cinco columnas, y la sexta columna se queda sin muestra. La sexta columna sirve como un control negativo en esta columna. Se colocan todos los componentes del medio sin una muestra de esputo y claramente cualquier crecimiento en esta columna indica que tenemos un problema con la contaminación cruzada y que toda la placa debe desecharse.

Cada placa que ejecutamos requiere una columna de control negativo. Así que ahora tenemos nuestra placa que contiene todas nuestras muestras y medios. Tenemos que añadir nuestras suspensiones de antibióticos en un plato aparte.

Hemos preparado nuestras diluciones como se ha descrito anteriormente de Rifampicina e Isid, y con un PET múltiple de cuatro canales, recogemos 100 microlitros de cada uno de estos pocillos y dispensamos 100 microlitros de siete H nueve OADC a cada uno de los dos pocillos de control y 100 microlitros de rifampicina y 100 microlitros de isid a cada uno de los dos pocillos que contienen el fármaco. Una vez que la placa está completa, se vuelve a colocar la tapa y se coloca dentro. A partir de este momento, una bolsa Ziploc no se vuelve a abrir y, por lo tanto, los cultivos que crecen en medios líquidos nunca tienen la oportunidad de salir de la bolsa.

Todas las lecturas de la placa a partir de ahora se realizan dentro de la bolsa, y la bolsa se coloca en una bolsa de autoclave y se desecha al final del cultivo. Y de esta manera, evitamos la manipulación de suspensiones altamente concentradas de micobacterias. Ahora solo diremos unas palabras sobre el control de calidad.

Hay controles de calidad incorporados en la metodología de mods, que son esenciales para el uso adecuado del ensayo. En primer lugar, hay controles negativos y estos se ejecutan en cada placa. Estos se han mencionado anteriormente, pero en resumen, tenemos una columna que contiene todos los componentes del medio sin la presencia de una muestra de esputo junto con otras cinco muestras de esputo en una placa, los pocillos de la columna deben examinarse como cualquier otro pocillo y la presencia de cualquier crecimiento en estos pocillos indica que se ha producido la contaminación cruzada y que, por lo tanto, no se puede confiar en ninguno de los resultados en la placa.

Por lo tanto, la placa debe desecharse y todas las muestras deben volver a colocarse. Además, hay controles internos que son controles positivos. Estos se colocan en una placa separada, y esta placa se prepara después de que todas las demás placas de muestra se hayan preparado al final del día para minimizar el riesgo de contaminación cruzada dentro del laboratorio.

En esta placa separada, ejecutamos una cepa totalmente susceptible de Mycobacterium tuberculosis y una cepa que es resistente a isid y rifampicina. Si existen preocupaciones sobre la transmisión de una cepa resistente a múltiples medicamentos en una placa, se puede ejecutar una cepa monorresistente a la rifampicina sin esta cepa monorresistente en lugar de estas dos cepas susceptibles y MDR. El propósito de estas cepas es demostrar no solo que los medios apoyan el crecimiento, por lo tanto, todos nuestros controles positivos deben tener un crecimiento en la riqueza libre de drogas, sino también que nuestras concentraciones de drogas son correctas y, por lo tanto, los controles positivos susceptibles no deben crecer en presencia de is y rifampicina y los controles positivos resistentes obviamente deben crecer a través de las concentraciones de rifampicina y is que están presentes en la placa.

Bien, ahora pasemos a la lectura del plato. Si nos fijamos en el día de emplatado de nuestros muestreadores, la lectura de la placa del día cero comienza el día cinco. Antes de eso, el crecimiento de micobacterias se observa muy raramente.

Las placas se examinan bajo un microscopio óptico invertido. Es decir, las placas se examinan de abajo hacia arriba, y esto nos permite ver muy claramente los cordones, tratando de visualizar los cultivos desde arriba se ve obstaculizado por la condensación en la tapa de las placas, y también porque la distancia focal no es la adecuada de un microscopio estándar. El examen microscópico generalmente se realiza con los 10 cultivos positivos objetivos considerados como uno en el que hay al menos dos unidades formadoras de colonias en ambos pozos libres de drogas.

La presencia de contaminación se reconoce fácilmente porque el medio se vuelve turbio y para el quinto día generalmente hay un crecimiento excesivo de la mayor parte del pozo. Por el contrario, el crecimiento de micobacterias no conduce a una turbidez del pozo El crecimiento inicial de las micobacterias forma pequeñas formas en forma de coma, que progresan constantemente para formar cordones o ovillos característicos. Dentro de dos semanas, un crecimiento fuertemente positivo habrá formado conglomerados de micobacterias con cordones solo realmente visibles en las extremidades.

La gran mayoría de los cultivos que van a ser positivos son positivos para el día 14, y por lo tanto recomendamos lecturas diarias desde el día cinco hasta el día 14 y a partir de entonces lecturas cada dos o tres días de acuerdo con la carga de trabajo del laboratorio el día que un cultivo sea claramente positivo en los dos pocillos libres de fármaco, se debe leer el pocillo que contiene el fármaco. Cualquier crecimiento en presencia de cualquiera de los fármacos indica resistencia a ese fármaco. Es muy importante tener en cuenta que si la región de los pocillos que contienen el fármaco se hace más de una semana después de que se observe un cultivo positivo en los pocillos sin fármaco, esto puede no representar resistencia, ya que se observa un crecimiento ocasional de la ruptura.

Las lecturas pueden detenerse en el día 21 si un cultivo es negativo, ya que los cultivos positivos después de este tiempo nunca se encuentran en pacientes que no reciben tratamiento. Al finalizar los 21 días de incubación, los cultivos pueden descartarse. Los cultivos permanecen dentro de sus bolsas Ziploc y se colocan en bolsas de autoclave y autoclave a 121 a 124 grados centígrados durante 45 a 60 minutos, después de lo cual se pueden desechar de manera segura. Solo voy a decir unas palabras ahora sobre la bioseguridad y el ensayo de mods, ya que hemos estado implementando mods no solo en Perú, sino también en entornos de África y Asia.

Surge una pregunta recurrente sobre la seguridad y la bioseguridad del uso de cultivos microbacterianos en medios líquidos. Este es un temor comprensible porque, obviamente, los líquidos se pueden derramar y los medios sólidos no conllevan ese riesgo, y también existe el riesgo de aerosolización cuando se trata de suspensiones de micobacterias. En realidad, es por estas mismas razones que creemos que la metodología mod es una metodología más segura que cualquier metodología que requiera pruebas indirectas de susceptibilidad a los medicamentos.

La razón de esto es que para las pruebas de susceptibilidad indirecta, se prepara una suspensión de una concentración conocida de microbacterias. Por lo tanto, esto implica la manipulación de soluciones altamente concentradas de microbacterias con todos los riesgos concomitantes de derrame y aerosolización. Por el contrario, la metodología mods, como ya habrás visto, consiste simplemente en la inoculación de una muestra de esputo en nuestra placa, después de lo cual la placa se sella dentro de una bolsa de plástico.

Esta bolsa nunca se vuelve a abrir y, por lo tanto, no tenemos que lidiar con estas suspensiones altamente concentradas. Esto no quiere decir que creamos que la metodología mod sea completamente segura, el manejo de micobacterias siempre conlleva un riesgo. Sin embargo, los datos de Corea publicados en 2006 parecen haber confirmado nuestra posición de que los mods no son más peligrosos que la eliminación de cualquier otra cultura.

Este fue un estudio que se llevó a cabo en trabajadores de laboratorio, que mostró que los riesgos ocupacionales para los trabajadores de laboratorio que sembraron cultivos y no tenían responsabilidad en las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos no eran mayores que los de aquellos que realizan microscopía de frotis de esputo. Por el contrario, aquellos que manipulan suspensiones de micobacterias y realizan pruebas de susceptibilidad a los medicamentos tienen tasas mucho más altas de riesgo ocupacional de tuberculosis. Claramente, es de suma importancia que todo el personal del laboratorio de trabajo esté protegido en la medida de lo posible y, por lo tanto, recomendamos encarecidamente que ninguno de estos procedimientos se lleve a cabo sin la protección respiratoria personal adecuada, es decir, las mascarillas estándar N95.

Además, se requiere una cabina o campana de seguridad biológica de clase dos en la que todas las áreas expulsadas se filtren a través de filtros HEPA. Finalmente, un mecanismo simple que es muy importante para evitar la turbulencia del flujo de aire dentro de un laboratorio es una cerradura en la puerta del laboratorio para detener la entrada y salida del personal mientras se procesan las muestras. Esto reduce el riesgo de transmisión dentro del laboratorio, por lo que espero que eso sea Les brindé una buena visión general de lo que implica la metodología mods y cuán útil podría ser en entornos donde los recursos son limitados, pero se requieren con urgencia diagnósticos de TB y MDR TB de alta calidad.

Para obtener más información, puede visitar nuestro sitio web, mods peru.org, donde encontrará nuestros procedimientos operativos estándar detallados, la guía del usuario de mods. Además de los SOP para el procesamiento de muestras extrapulmonares, también disponemos de una fototeca de micobacterias y tuberculosis, otras micobacterias y contaminación bacteriana y fúngica, y también puede encontrar nuestra estrategia de aseguramiento de la calidad y el procedimiento que recomendamos para la acreditación de laboratorios para empezar a utilizar mods.

Finalmente, hay una hoja de preguntas frecuentes, y agradecemos cualquier comentario de los usuarios que actualmente usan mods, ya que esta es una metodología iterativa. Como explicamos anteriormente, es una prueba no propietaria y siempre estamos interesados en las mejoras que otros laboratorios han logrado hacer.