Protocolos para la infección oral de larvas de lepidópteros con Baculovirus

En este vídeo, que muestran técnicas de infección oral de larvas de lepidópteros con baculovirus con el fin de determinar la eficacia de insecticidas.

El virus Vao se usa comúnmente como un vector de ADN utilizado en combinación con líneas celulares de insectos para la expresión de proteínas. Sin embargo, el hecho de que este virus infecte eficazmente a los insectos con consecuencias letales también lo convierte en un agente insecticida eficaz. En Brasil, por ejemplo, el virus Balo de tipo silvestre se aplica anualmente a más de 1 millón de hectáreas de cultivos de soja para el control de la oruga del frijol terciopelo para mejorar su eficacia insecticida, los virus Balo han sido modificados genéticamente con genes que codifican toxinas específicas de insectos que están activas dentro del HemosIL del insecto.

En este video, demostramos métodos para la infección oral de larvas de lepidópteros con el virus bacao con el fin de analizar la eficacia de los insecticidas. Hola, soy del laboratorio de deshuesado ciego en el Departamento de Oftalmología y la Universidad Estatal de Iowa, y soy Wendy Sparks también del laboratorio de deshuesado. Hoy le mostraremos dos procedimientos para la infección por el virus VA de lter y larvas.

En primer lugar, le mostrará cómo infectar las larvas de neonatos utilizando un bioensayo de alimentación por gotículas. Y luego le mostraré cómo infectar larvas de estadio medio a tardío utilizando un bioensayo de sangre dietético. Así que comencemos.

Los bioensayos de alimentación por gotículas se pueden utilizar para determinar la dosis letal de abacavir y la supervivencia. Época de larvas infectadas con el virus del balo. Las larvas de estadio temprano o neonato se utilizan generalmente para este ensayo.

Antes de comenzar, asegúrese de tener a mano tazas dietéticas con la dieta adecuada. Además, prepare las diluciones de virus adecuadas que incluyan colorante alimentario verde hasta una concentración del 4% por volumen. Para determinar la concentración viral letal, la dilución debe dar un rango de mortalidad entre uno y 99%Es posible que se requieran bioensayos preliminares para determinar un rango apropiado de concentraciones de virus después de vórtice el tubo para evitar la sedimentación de los poliedros, haga dos círculos concéntricos de pequeñas gotas de la solución viral en una placa de Petri de 60 milímetros.

Para cada concentración de virus utilizada, recuerde también configurar un simulacro de infección de control negativo. Tratamiento A continuación, transfiera de 25 a 30 larvas neonatas al centro de los círculos concéntricos con un pincel estéril. Coloque la tapa en el plato y selle con paraform para evitar que las larvas se escapen.

Lo ideal es utilizar diferentes pinceles para la transferencia a cada tipo de virus para evitar la contaminación entre tratamientos. Deje reposar el plato a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos, tiempo durante el cual las larvas beben. Las larvas de la solución que se han alimentado se pueden identificar por la coloración verde del intestino anterior resultante de la transferencia de colorante alimentario verde, solo aquellas larvas que se han alimentado a vasos de plástico de una onza, que contienen dieta, transfieren una larva por taza.

Después de transferir las larvas, cubra las tazas con tapas e incube a 28 grados centígrados 24 horas después de la infección. Elimina cualquier vaso que contenga larvas muertas. Es probable que estas muertes prematuras sean el resultado de lesiones por manipulación.

Cuando se utiliza este bioensayo para determinar la dosis letal, las larvas deben examinarse cada dos o tres días hasta que las larvas infectadas simuladas y las larvas tratadas con virus supervivientes hayan purificado o hayan comenzado a tomar prestado para pupar. Las larvas infectadas por el virus permanecerán en la parte superior del alimento y luego morirán después de unos días. Las larvas muertas a veces se vuelven negras, las larvas que mueren por infección se convierten esencialmente en bolsas de poliedros, que se disuelven por completo. Si se altera mecánicamente en este momento, se anote la mortalidad larvaria en cada tratamiento.

Los bioensayos de concentración letal deben repetirse tres o cuatro veces en ocasiones separadas. Use 30 individuos por dosis para cada virus o tratamiento de control. Utilice un programa de análisis de sucesiones adecuado, como polo o SAS, para calcular los valores de lc 50, los intervalos de confianza del 95% y las estadísticas adecuadas.

Este ensayo de alimentación por gotitas también se puede utilizar para determinar los valores de tiempo de supervivencia de ST 50. En este caso, la mortalidad de las larvas se puntúa cada cuatro a ocho horas con observaciones más frecuentes. Si la tasa de mortalidad es alta, los bioensayos de tiempo de supervivencia se realizan utilizando una dosis de lc 99 del virus, la mediana de los tiempos de supervivencia y los límites de confianza del 95% se calculan utilizando el estimador de Kaplan Mayer utilizando un programa s plus o SAS.

Ahora que Harang le ha mostrado el bioensayo de alimentación por gotas, le mostraré el bioensayo de tapón de dieta En bioensayo de tapón de dieta. Las larvas de estadio medio a tardío se alimentan con un tapón dietético tratado con una dosis conocida de virus para determinar la dosis letal o LD 50 el día anterior a la realización de este ensayo. Retire la dieta de la taza para matar de hambre a las larvas durante la noche.

Este paso aumentará la velocidad con la que las larvas consumen el virus. Cubo de dieta inoculado al día siguiente, prepare la dieta cortándola en cubos pequeños de unos dos milímetros cúbicos. Si los cubos de dieta son demasiado pequeños, se secarán.

Si los cubos de dieta son demasiado grandes, las larvas no podrán consumir todo el cubo de dieta durante la noche. Ahora agregue uno o dos microlitros de suspensión de poliedros a cada cubo de dieta. La suspensión contiene un 4% de colorante alimentario en volumen.

Deje que la suspensión penetre en la dieta durante cinco a 15 minutos. Recuerde preparar también un cubo de dieta simulado tratado con virus como control negativo. A continuación, transfiera un cubo de dieta a cada cuarta larva de estadio en cada taza.

Luego coloque tazas en la incubadora durante la noche a 28 grados centígrados al día siguiente, deseche las larvas que no hayan comido completamente el cubo de dieta. Luego agregue una gran cantidad de dieta a cada taza para las larvas restantes. Mantenga las larvas a 28 grados centígrados, agregando dieta adicional según sea necesario hasta que las larvas infectadas simuladas y las larvas infectadas por virus sobrevivientes hayan comido o comenzado a pupar.

En este momento, registre el número de insectos muertos y sobrevivientes. Solo le mostraremos dos métodos para infectar insectos con virus de la espalda, el sangrado, la biopsia de alimentación y la biopsia de placa de dieta. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los cadáveres de las larvas muertas por el virus suelen ser frágiles y pueden romperse fácilmente liberando el virus.

Por lo tanto, esterilice las superficies de trabajo y deseche los guantes contaminados y los materiales desechables de manera adecuada para evitar la contaminación. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.