Name: Protocolos para la infección oral de larvas de lepidópteros con Baculovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-03T23:29:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprende técnicas de infección oral de larvas de lepidópteros con baculovirus para evaluar eficacia insecticida. Incluye bioensayos de gota y tapón de dieta con controles adecuados.

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Por favor, visite <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">Protocolos Springer</a> para aprender más sobre la ingeniería de baculovirus como un agente insecidical y las técnicas de infección oral que se usa en este ensayo.

Los autores no tienen nada que revelar.

protocolos para la infección oral de larvas de lepidópteros con baculovirus

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Los baculovirus son ampliamente utilizados tanto como vectores de expresión de la proteína y como agentes de control de plagas de insectos. Este vídeo muestra cómo las larvas de lepidópteros se pueden infectar con poliedros por la alimentación de las gotas y una dieta basada en plug-bioensayos. Esto acompañado de Protocolos Springer sección proporciona una visión general del ciclo de vida de baculovirus y el uso de baculovirus como agentes insecticidas, incluyendo la discusión de los pros y los contras del uso de baculovirus como insecticidas, y los progresos realizados en la mejora genética de los baculovirus para mejorar la eficacia insecticida.

En este vídeo, que muestran técnicas de infección oral de larvas de lepidópteros con baculovirus con el fin de determinar la eficacia de insecticidas.

Protocolos para la infección oral de larvas de lepidópteros con Baculovirus

Los baculovirus se utilizan ampliamente tanto como vectores de expresión proteica como agentes de control de plagas de insectos. Este video muestra cómo las larvas de lepidópteros pueden ser...

El virus Vao se utiliza comúnmente como vector de ADN en combinación con líneas celulares de insectos para la expresión de proteínas. Sin embargo, el hecho de que este virus infecte eficazmente a los insectos con consecuencias letales también lo convierte en un agente insecticida eficaz. En Brasil, por ejemplo, el virus balo de tipo silvestre se aplica anualmente a más de 1 millón de hectáreas de cultivos de soja para el control de la oruga del frijol terciopelo, con el fin de aumentar su eficacia insecticida. Los virus Balo han sido modificados genéticamente con genes que codifican toxinas específicas para insectos que son activas dentro del hemoceloma del insecto.En este video, demostramos métodos para la infección oral de larvas de lepidópteros con virus bacao con el fin de analizar la eficacia insecticida. Hola, soy del laboratorio Blind Boning del Departamento de Oftalmología de la Universidad Estatal de Iowa, y yo soy Wendy Sparks, también del laboratorio Boning. Hoy les mostraremos dos procedimientos para la infección de larvas de Lter con el virus VA.Primero, Harran les mostrará cómo infectar larvas neonatas utilizando un bioensayo por alimentación con gotas. Luego, yo les mostraré cómo infectar larvas de estadios medio a tardío utilizando un bioensayo con dieta sanguínea. Así que comencemos.Los bioensayos de alimentación con gotas pueden utilizarse para determinar la dosis letal de abacavir y la supervivencia en función del tiempo de larvas infectadas con el virus balo. Generalmente, se utilizan larvas de primer estadio o neonatas para este ensayo.Antes de comenzar, asegúrese de tener copas de dieta con la dieta adecuada a mano. Además, prepare las diluciones de virus apropiadas que incluyan colorante alimentario verde hasta una concentración del 4 % en volumen. Con el fin de determinar la concentración viral letal, la dilución debe producir un rango de mortalidad entre el 1 % y el 99 %. Pueden ser necesarios bioensayos preliminares para determinar un rango adecuado de concentraciones de virus. Después de agitar el tubo en vórtex para evitar la sedimentación de los poliedros, haga dos círculos concéntricos de pequeñas gotas de la solución de virus en una placa de Petri de 60 milímetros.Para cada concentración de virus utilizada, recuerde establecer también una infección simulada como control negativo. A continuación, transfiera de 25 a 30 larvas neonatas al centro de los círculos concéntricos utilizando un pincel estéril. Coloque la tapa en la placa y séllela con parafina para evitar que las larvas escapen.Lo ideal es utilizar pinceles diferentes para la transferencia a cada tipo de virus con el fin de evitar la contaminación entre tratamientos. Deje el recipiente reposar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos, tiempo durante el cual las larvas beberán. Las larvas que se han alimentado pueden identificarse por la coloración verde del intestino anterior, resultado del colorante alimentario verde; transfiera únicamente las larvas que se han alimentado a vasos plásticos de una onza que contengan dieta, colocando una larva por vaso.Después de transferir las larvas, cubra los vasos con tapas e incube a 28 grados Celsius durante 24 horas tras la infección. Elimine cualquier vaso que contenga larvas muertas. Estas muertes tempranas probablemente se deben a lesiones por manipulación.Al utilizar este bioensayo para determinar la dosis letal, las larvas deben revisarse cada dos o tres días hasta que las larvas control no infectadas y cualquier larva tratada con virus que haya sobrevivido hayan purgado o comenzado a excavar para puparse; las larvas infectadas por el virus permanecerán en la superficie del alimento y luego morirán después de unos días. Las larvas muertas a veces se encogen y se vuelven negras; las larvas que mueren por infección esencialmente se convierten en bolsas de poliedros, que se disolverán completamente. Si se perturban mecánicamente en este momento, registre la mortalidad larval en cada tratamiento.Los bioensayos de concentración letal deben repetirse tres o cuatro veces en ocasiones separadas. Utilice 30 individuos por dosis para cada tratamiento con virus o control. Utilice un programa adecuado de análisis probit, como polo o SAS, para calcular los valores de CL50, los intervalos de confianza al 95 % y las estadísticas apropiadas.Este ensayo de alimentación con gotas también puede utilizarse para determinar los valores de tiempo de supervivencia ST50. En este caso, la mortalidad de las larvas se registra cada cuatro a ocho horas con observaciones más frecuentes. Si la tasa de mortalidad es alta, los bioensayos de tiempo de supervivencia se realizan utilizando una dosis LC99 del virus; los tiempos medios de supervivencia y los límites de confianza del 95 % se calculan mediante el estimador de Kaplan-Meier utilizando un programa S-PLUS o SAS.Ahora que Harang les ha mostrado el bioensayo de alimentación mediante gotas, les mostraré el bioensayo con tapón de dieta. En el bioensayo con tapón de dieta, larvas de instar medio a tardío se alimentan con un tapón de dieta tratado con una dosis conocida de virus para determinar la dosis letal o DL50. El día anterior a la realización de este ensayo, retire la dieta del vaso para ayunar a las larvas durante la noche.Este paso aumentará la velocidad con la que las larvas consumen el virus. Al día siguiente, inocular el cubo de dieta; prepare la dieta cortándola en cubos pequeños de aproximadamente dos milímetros cúbicos. Si los cubos de dieta son demasiado pequeños, se secarán.Si los cubos de dieta son demasiado grandes, las larvas no podrán consumir todo el cubo de dieta durante la noche. Añada ahora uno a dos microlitros de suspensión de poliedros a cada cubo de dieta. La suspensión contiene un 4 % en volumen de colorante alimentario.Deje que la suspensión se impregne en la dieta durante cinco a quince minutos. Recuerde preparar también un cubo de dieta tratado con virus simulado como control negativo. A continuación, transfiera un cubo de dieta a cada larva de cuarto estadio en cada vaso.Luego, coloque los vasos en el incubador durante la noche a 28 grados Celsius. Al día siguiente, deseche cualquier larva que no haya consumido completamente el cubo de dieta. A continuación, agregue un trozo grande de dieta a cada vaso para las larvas restantes. Mantenga las larvas a 28 grados Celsius, añadiendo dieta adicional según sea necesario hasta que las larvas mock infectadas y las larvas infectadas con virus que sobrevivieron hayan comido o comenzado a pupar.En este momento, registre los números de insectos muertos y sobrevivientes. Mostraremos únicamente dos métodos para infectar insectos con el virus de la polilla, el sangrado, la biopsia por alimentación y la biopsia de placa de dieta. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los cadáveres de larvas muertas por el virus son típicamente frágiles y pueden romperse fácilmente, liberando así el virus.Por lo tanto, esterilice las superficies de trabajo y deseche los guantes contaminados y los materiales desechables de manera adecuada para prevenir la contaminación. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este vídeo, que muestran dos técnicas microaplicador utilizado para infectar de larvas de lepidópteros con baculovirus con el fin de determinar la eficacia de insecticidas.

Protocolos para microaplicador, asistida por la infección de las larvas de lepidópteros con Baculovirus

El método descrito aquí utiliza la inyección directa de bacterias entomopatógenos en el hemocele...

Crianza y la inyección de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Las larvas para evaluar la virulencia bacteriana

Haemocolic infección intra oral y de las larvas de la polilla mayor de la...

El insecto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como un modelo de infección poderosa para investigar la patogénesis bacteriana

Este video muestra un método para establecer un modelo de infección por Mycobacterium bovis en las larvas de la polilla de la cera mayor, Galleria mellonella. Se inyecta una cepa bioluminiscente de Mycobacterium bovis BCG en la hemolinfa de la larva para establecer la infección, y la bioluminiscencia se mide a intervalos predefinidos para estudiar el progreso de la infección.

Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en larvas de insectos

La mosca mediterránea de la fruta (mosca del mediterráneo) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) es una plaga mundial de la agricultura. Una comprensión más profunda de su biología es clave para controlar las poblaciones de moscamed y, por lo tanto, reducir el impacto económico. La microinyección embrionaria es una herramienta fundamental que permite tanto la transformación de la línea germinal como los estudios de genética inversa en esta especie.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Este protocolo describe un calor proteína inducida por choque expresión sistema (pDHsp/V5-su/sf9 de la célula), que puede utilizarse para evaluar la actividad anti-apoptótica de posibles proteínas extrañas y su truncado amino o expresando proteínas extrañas ácidos en las células de los insectos.

Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas

En este protocolo, baculovirus es producida por transitorios de la transfección del plásmido de baculovirus en células Sf9 y amplificado en una cultura de suspensión libre de suero. El sobrenadante es purificado por cromatografía de afinidad de heparina y más concentrado por ultracentrifugación. Este protocolo es útil para la producción y purificación de baculovirus para el uso de la terapia génica.

Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Aquí, presentamos un protocolo para producir casa mosca carboxilesterasa proteínas en vitro con un sistema de expresión de baculovirus mediada por células de insectos y caracterizar funcionalmente más adelante su papel en la metabolización de permetrina, de tal modo, que confieren piretroides resistencia mediante la realización de celular MTT análisis y en vitro estudios metabólicos.

Caracterización funcional de carboxilesterasas en casa resistente al insecticida moscas, Musca Domestica

Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

El sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) es una plataforma robusta para la detección de expresión y la producción de proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs) que se utilizarán para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales. Cantidades de miligramo de material se pueden producir para la mayoría de prmts y otras proteínas de interés que requieren una plataforma de expresión eucariota.

Producción De Proteínas Prmt Recombinantes Utilizando El Sistema De Vectores De Expresión De Baculovirus

Los estudios estructurales y bioquímicos de los transportadores de membrana humana requieren cantidades de miligramos de proteína estable, intacta y homogénea. Aquí describimos métodos escalables para seleccionar, expresar y purificar transportadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones.

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Aprende técnicas de infección oral de larvas de lepidópteros con baculovirus para evaluar eficacia insecticida. Incluye bioensayos de gota y tapón de dieta con controles adecuados.

Protocolos para la infección oral de larvas de lepidópteros con Baculovirus

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