Protocolos para microaplicador, asistida por la infección de las larvas de lepidópteros con Baculovirus

Aunque el virus baccala específico de los artrópodos se utiliza como una herramienta estándar de investigación para sistemas de expresión de proteínas eucariotas, también se está desarrollando como un agente insecticida seguro para el medio ambiente, capaz de matar insectos herbívoros como los lepidópteros en la naturaleza. Las larvas de lepidópteros se infectan con virus baccala al ingerir follaje infectado. Las larvas o orugas ingieren el virus baccala en una forma conocida como poliedro, que es un complejo de partículas virales empaquetadas en una gran estructura proteica cristalina que protege al virus de la desecación.

Una vez que la larva está infectada, el virus se disemina dentro del insecto. El virus secuestra la maquinaria del huésped para la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas con el fin de producir más virus y poliedros. Eventualmente, la larva queda tan completamente infectada que se desintegra en un exudado viscoso lleno de poliedros, el cual gotea sobre las superficies de las plantas ingeridas por el insecto, reiniciándose así el ciclo para determinar la eficacia insecticida de un determinado Baca.

Las técnicas de microaplicación de cepas víricas y los bioensayos pueden combinarse. Las larvas de Leid dorin pueden infectarse mediante la inyección del virus en el hemoceloma o cavidad corporal, y se pueden evaluar las tasas de mortalidad. Además, las larvas pueden infectarse con poliedros mediante inyección asistida por microaplicador oral, y puede analizarse el momento de la infección del intestino y otros tejidos.

Hola, soy Wendy Sparks en el laboratorio de Brian e boning en el Departamento de Entomología de la Universidad Estatal de Iowa y también soy de boning snap. Hoy les mostraremos dos procedimientos para infectar Drosophila de laboratorio con el virus backlog. Ambos métodos utilizan un microaplicador.

En primer lugar, le mostraré cómo utilizar un microaplicador para administrar el virus corporal en el heni a través del prole. Luego, le mostraré cómo usar el microaplicador para administrar polímero en el mid guard a través del ratón. Comencemos.

Cuando se desarrollan con fines insecticidas, los virus balo suelen contener el gen de la poliedrina para facilitar la infección oral de las larvas de plagas. Sin embargo, en ocasiones existen razones para probar un virus baccala sin poliedrina con el fin de evaluar sus posibles efectos insecticidas o para evitar el paso por el intestino del insecto. En este caso, puede realizarse la inyección del virus desnudo mediante un microaplicador para infectar a las larvas antes de iniciar el ensayo.

El título del lote de trabajo del virus debe determinarse mediante un ensayo de placas o ensayos de dilución en punto final. Para experimentos fisiológicos, las inyecciones de cinco veces 10 a la cuarta PFU por quinto estadio H VNS serían típicas. Para comenzar este bioensayo, cargue cada dilución del virus en una jeringa plástica de un cc con una aguja fina de calibre 28,5 o 32.

Generalmente, uno a tres microlitros de solución de virus butado con una titulación de 10 a la séptima hasta 10 a la octava por mililitro pueden utilizarse para cada larva, de modo que cargar de 300 a 500 microlitros en la jeringa es suficiente para la mayoría de los fines. A continuación, expulse las burbujas de aire de la jeringa sosteniéndola en posición vertical para que el aire ascienda hasta la punta de la aguja y luego dispensando el líquido.

Luego fije la jeringa al tubo de soporte de la jeringa. Ahora ajuste el volumen a 1,0 microlitro. Para cada gota en la unidad de control del microaplicador, calibre primero la unidad de control para asegurar que se dispensa el volumen correcto; la velocidad con la que se dispensa la gota puede ajustarse en una escala de cero a nueve.

Se utiliza comúnmente un rango de cero a uno. Presione el interruptor de pedal para asegurarse de que la solución se dispensa adecuadamente. Recuerde que si se dispensa demasiada solución o si la aplicación es demasiado lenta, los ajustes de volumen y velocidad se pueden modificar hasta que se aplique el volumen adecuado de solución a la velocidad correcta.

Ahora estoy listo para comenzar la inyección para la infección por H VNS. Generalmente se inyectan larvas de quinto estadio temprano, ya que el tamaño mayor de los estadios posteriores facilita el proceso de inyección. Introduzca la punta de la aguja a través de la placa de una de las patas prostigmáticas y dentro de la cavidad corporal.

Tenga en cuenta que, cuando la punta de la aguja se inserte en la prole, cambie la posición del cuerpo de la larva para evitar dañar el intestino y la pared corporal; ahora presione el interruptor de pedal cuatro veces para administrar cuatro microlitros de la solución viral dentro del sello hemo. Una vez finalizadas las inyecciones, devuelva todas las larvas al incubador a 28 grados Celsius. Revise frecuentemente la presencia de larvas muertas y asegúrese de que haya dieta suficiente disponible para las larvas sobrevivientes.

Aunque las larvas de últimos estadios no mueren por lesiones en el exoesqueleto causadas por la inyección, aún así se debe verificar su estado 24 horas después de la inyección, por si hubiera daño en el intestino, lo que podría deberse a una infección bacteriana. Esta mortalidad temprana debe excluirse del análisis de datos. Si se utiliza el bioensayo asistido por microaplicador con virus aplicado por contacto para bioensayos de concentración letal, el bioensayo debe repetirse tres o cuatro veces en ocasiones separadas.

Utilice 30 individuos por dosis para cada tratamiento con virus o control. Utilice un programa adecuado de análisis probit, como polo o SAS, para calcular los valores de CL50, los intervalos de confianza al 95 % y las estadísticas apropiadas. Este bioensayo también puede utilizarse para determinar los valores de tiempo de supervivencia ST50 tras la inoculación con una dosis fija de virus.

En este caso, la mortalidad de las larvas se registra cada cuatro a ocho horas con observaciones más frecuentes. Si la tasa de mortalidad es alta, los tiempos medios de supervivencia dentro de los límites de confianza del 95 % se calculan utilizando el estimador de Kaplan-Meier con un programa S-Plus o SAS. Ahora que Harran le ha mostrado el bioensayo asistido por microaplicador utilizando el virus butted.

Le mostraré el ensayo. La inoculación oral de poliedros directamente en el intestino del insecto se utiliza cuando el momento exacto de la infección es crítico. Por ejemplo, al monitorear cómo el virus se disemina dentro del insecto, para comenzar este ensayo suspenda los poliedros en una solución neutra de flotación de tres a dos de glicerina y agua del 10 al 300.

Los poliedros podrían utilizarse para la cuarta ínsita h ance, por ejemplo. Luego cargue esta solución en una jeringa de tuberculina de plástico o vidrio de un CC con una aguja de punta roma de calibre 32. Coloque la jeringa en el tubo de soporte del microaplicador mirando a través de un microscopio.

Sujete la larva estrella en el cuarto o quinto estadio, inserte la aguja a través de la boca y en la región anterior del intestino medio, luego administre los poliedros. Esta técnica requiere algo de práctica. En primer lugar, puede ser difícil sostener las larvas con guantes sin aplastarlas.

En segundo lugar, se necesita algo de práctica para guiar la aguja más allá de las piezas bucales. Recomendamos practicar la inoculación de aproximadamente 30 larvas con PBS. Si llega a perforar el intestino, será evidente porque las larvas melanizarán y se volverán negras bastante rápidamente.

Nuevamente, dado que la inoculación oral asistida por microaplicador proporciona el momento exacto de la infección, este método resulta más útil para experimentos en los que es importante determinar el tiempo de infección para conocer cómo se disemina el virus dentro del insecto. Por ejemplo, se pueden inocular oralmente virus que expresan beta galactosidasa en larvas, las cuales luego se disecan en diferentes puntos temporales para determinar qué tejidos se infectan y cuándo. Solo mostraremos dos métodos de infección asistidos por microaplicador. Insectos infectados con virus, el primero de los cuales fue la inoculación directa a través de la pata del proleg del virus inyectado, lo que permite sortear la fisiología del intestino y evaluar la letalidad y el tiempo letal del virus de interés.

La segunda técnica fue la inoculación directa en el intestino medio utilizando poliedros. Esto permite administrar una dosis muy precisa directamente en el intestino medio, así como controlar con gran exactitud el momento del evento. Luego, también se pueden estudiar la mortalidad y otros fenotipos del virus.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las larvas muertas por el virus de la baula suelen ser frágiles y pueden romperse fácilmente, liberando así el virus. Por lo tanto, se deben esterilizar las superficies de trabajo y desechar los guantes contaminados y los materiales desechables de manera adecuada para prevenir la contaminación. Eso es todo.

Gracias por verlo. Buena suerte con su experimento.