Name: Protocolos para microaplicador, asistida por la infección de las larvas de lepidópteros con Baculovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-23T13:32:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda técnicas de microaplicador para infectar larvas de lepidópteros con baculovirus mediante inyección directa de virus o inoculación oral de poliedros. Estos métodos permiten evaluar la eficacia insecticida con precisión.

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Por favor, visite <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-457-5_18">Protocolos Springer</a> para aprender más sobre la ingeniería de baculovirus como un agente insecidical y las técnicas microaplicador utilizado en este ensayo.

Los autores no tienen nada que revelar.

protocolos para microaplicador, asistida por la infección de las larvas de lepidópteros con baculovirus

Protocols for Microapplicator-assisted Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Los baculovirus son ampliamente utilizados tanto como vectores de expresión de la proteína y como agentes de control de plagas de insectos. . Este vídeo muestra cómo las larvas de lepidópteros se pueden infectar con técnicas microaplicador en el intestino con poliedros baculovirus y en la hemolinfa con el virus floreció. Esto acompañado de Protocolos Springer sección proporciona una visión general del ciclo de vida de baculovirus y el uso de baculovirus como agentes insecticidas. Formulación y aplicación de baculovirus para el control de plagas se describen en otros lugares.

En este vídeo, que muestran dos técnicas microaplicador utilizado para infectar de larvas de lepidópteros con baculovirus con el fin de determinar la eficacia de insecticidas.

Protocolos para microaplicador, asistida por la infección de las larvas de lepidópteros con Baculovirus

Los baculovirus se utilizan ampliamente tanto como vectores de expresión de proteínas como agentes de control de plagas de insectos. Este video muestra cómo las larvas de lepidópteros pueden ser...

Aunque el virus baccala específico de los artrópodos se utiliza como una herramienta estándar de investigación para sistemas de expresión de proteínas eucariotas, también se está desarrollando como un agente insecticida seguro para el medio ambiente, capaz de matar insectos herbívoros como los lepidópteros en la naturaleza. Las larvas de lepidópteros se infectan con virus baccala al ingerir follaje infectado. Las larvas o orugas ingieren el virus baccala en una forma conocida como poliedro, que es un complejo de partículas virales empaquetadas en una gran estructura proteica cristalina que protege al virus de la desecación.Una vez que la larva está infectada, el virus se disemina dentro del insecto. El virus secuestra la maquinaria del huésped para la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas con el fin de producir más virus y poliedros. Eventualmente, la larva queda tan completamente infectada que se desintegra en un exudado viscoso lleno de poliedros, el cual gotea sobre las superficies de las plantas ingeridas por el insecto, reiniciándose así el ciclo para determinar la eficacia insecticida de un determinado Baca.Las técnicas de microaplicación de cepas víricas y los bioensayos pueden combinarse. Las larvas de Leid dorin pueden infectarse mediante la inyección del virus en el hemoceloma o cavidad corporal, y se pueden evaluar las tasas de mortalidad. Además, las larvas pueden infectarse con poliedros mediante inyección asistida por microaplicador oral, y puede analizarse el momento de la infección del intestino y otros tejidos.Hola, soy Wendy Sparks en el laboratorio de Brian e boning en el Departamento de Entomología de la Universidad Estatal de Iowa y también soy de boning snap. Hoy les mostraremos dos procedimientos para infectar Drosophila de laboratorio con el virus backlog. Ambos métodos utilizan un microaplicador.En primer lugar, le mostraré cómo utilizar un microaplicador para administrar el virus corporal en el heni a través del prole. Luego, le mostraré cómo usar el microaplicador para administrar polímero en el mid guard a través del ratón. Comencemos.Cuando se desarrollan con fines insecticidas, los virus balo suelen contener el gen de la poliedrina para facilitar la infección oral de las larvas de plagas. Sin embargo, en ocasiones existen razones para probar un virus baccala sin poliedrina con el fin de evaluar sus posibles efectos insecticidas o para evitar el paso por el intestino del insecto. En este caso, puede realizarse la inyección del virus desnudo mediante un microaplicador para infectar a las larvas antes de iniciar el ensayo.El título del lote de trabajo del virus debe determinarse mediante un ensayo de placas o ensayos de dilución en punto final. Para experimentos fisiológicos, las inyecciones de cinco veces 10 a la cuarta PFU por quinto estadio H VNS serían típicas. Para comenzar este bioensayo, cargue cada dilución del virus en una jeringa plástica de un cc con una aguja fina de calibre 28,5 o 32.Generalmente, uno a tres microlitros de solución de virus butado con una titulación de 10 a la séptima hasta 10 a la octava por mililitro pueden utilizarse para cada larva, de modo que cargar de 300 a 500 microlitros en la jeringa es suficiente para la mayoría de los fines. A continuación, expulse las burbujas de aire de la jeringa sosteniéndola en posición vertical para que el aire ascienda hasta la punta de la aguja y luego dispensando el líquido.Luego fije la jeringa al tubo de soporte de la jeringa. Ahora ajuste el volumen a 1,0 microlitro. Para cada gota en la unidad de control del microaplicador, calibre primero la unidad de control para asegurar que se dispensa el volumen correcto; la velocidad con la que se dispensa la gota puede ajustarse en una escala de cero a nueve.Se utiliza comúnmente un rango de cero a uno. Presione el interruptor de pedal para asegurarse de que la solución se dispensa adecuadamente. Recuerde que si se dispensa demasiada solución o si la aplicación es demasiado lenta, los ajustes de volumen y velocidad se pueden modificar hasta que se aplique el volumen adecuado de solución a la velocidad correcta.Ahora estoy listo para comenzar la inyección para la infección por H VNS. Generalmente se inyectan larvas de quinto estadio temprano, ya que el tamaño mayor de los estadios posteriores facilita el proceso de inyección. Introduzca la punta de la aguja a través de la placa de una de las patas prostigmáticas y dentro de la cavidad corporal.Tenga en cuenta que, cuando la punta de la aguja se inserte en la prole, cambie la posición del cuerpo de la larva para evitar dañar el intestino y la pared corporal; ahora presione el interruptor de pedal cuatro veces para administrar cuatro microlitros de la solución viral dentro del sello hemo. Una vez finalizadas las inyecciones, devuelva todas las larvas al incubador a 28 grados Celsius. Revise frecuentemente la presencia de larvas muertas y asegúrese de que haya dieta suficiente disponible para las larvas sobrevivientes.Aunque las larvas de últimos estadios no mueren por lesiones en el exoesqueleto causadas por la inyección, aún así se debe verificar su estado 24 horas después de la inyección, por si hubiera daño en el intestino, lo que podría deberse a una infección bacteriana. Esta mortalidad temprana debe excluirse del análisis de datos. Si se utiliza el bioensayo asistido por microaplicador con virus aplicado por contacto para bioensayos de concentración letal, el bioensayo debe repetirse tres o cuatro veces en ocasiones separadas.Utilice 30 individuos por dosis para cada tratamiento con virus o control. Utilice un programa adecuado de análisis probit, como polo o SAS, para calcular los valores de CL50, los intervalos de confianza al 95 % y las estadísticas apropiadas. Este bioensayo también puede utilizarse para determinar los valores de tiempo de supervivencia ST50 tras la inoculación con una dosis fija de virus.En este caso, la mortalidad de las larvas se registra cada cuatro a ocho horas con observaciones más frecuentes. Si la tasa de mortalidad es alta, los tiempos medios de supervivencia dentro de los límites de confianza del 95 % se calculan utilizando el estimador de Kaplan-Meier con un programa S-Plus o SAS. Ahora que Harran le ha mostrado el bioensayo asistido por microaplicador utilizando el virus butted.Le mostraré el ensayo. La inoculación oral de poliedros directamente en el intestino del insecto se utiliza cuando el momento exacto de la infección es crítico. Por ejemplo, al monitorear cómo el virus se disemina dentro del insecto, para comenzar este ensayo suspenda los poliedros en una solución neutra de flotación de tres a dos de glicerina y agua del 10 al 300.Los poliedros podrían utilizarse para la cuarta ínsita h ance, por ejemplo. Luego cargue esta solución en una jeringa de tuberculina de plástico o vidrio de un CC con una aguja de punta roma de calibre 32. Coloque la jeringa en el tubo de soporte del microaplicador mirando a través de un microscopio.Sujete la larva estrella en el cuarto o quinto estadio, inserte la aguja a través de la boca y en la región anterior del intestino medio, luego administre los poliedros. Esta técnica requiere algo de práctica. En primer lugar, puede ser difícil sostener las larvas con guantes sin aplastarlas.En segundo lugar, se necesita algo de práctica para guiar la aguja más allá de las piezas bucales. Recomendamos practicar la inoculación de aproximadamente 30 larvas con PBS. Si llega a perforar el intestino, será evidente porque las larvas melanizarán y se volverán negras bastante rápidamente.Nuevamente, dado que la inoculación oral asistida por microaplicador proporciona el momento exacto de la infección, este método resulta más útil para experimentos en los que es importante determinar el tiempo de infección para conocer cómo se disemina el virus dentro del insecto. Por ejemplo, se pueden inocular oralmente virus que expresan beta galactosidasa en larvas, las cuales luego se disecan en diferentes puntos temporales para determinar qué tejidos se infectan y cuándo. Solo mostraremos dos métodos de infección asistidos por microaplicador. Insectos infectados con virus, el primero de los cuales fue la inoculación directa a través de la pata del proleg del virus inyectado, lo que permite sortear la fisiología del intestino y evaluar la letalidad y el tiempo letal del virus de interés.La segunda técnica fue la inoculación directa en el intestino medio utilizando poliedros. Esto permite administrar una dosis muy precisa directamente en el intestino medio, así como controlar con gran exactitud el momento del evento. Luego, también se pueden estudiar la mortalidad y otros fenotipos del virus.Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las larvas muertas por el virus de la baula suelen ser frágiles y pueden romperse fácilmente, liberando así el virus. Por lo tanto, se deben esterilizar las superficies de trabajo y desechar los guantes contaminados y los materiales desechables de manera adecuada para prevenir la contaminación. Eso es todo.Gracias por verlo. Buena suerte con su experimento.

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Investigación

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Biology

Biología

En este vídeo, que muestran técnicas de infección oral de larvas de lepidópteros con baculovirus con el fin de determinar la eficacia de insecticidas.

Protocolos para la infección oral de larvas de lepidópteros con Baculovirus

El método descrito aquí utiliza la inyección directa de bacterias entomopatógenos en el hemocele...

Crianza y la inyección de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Las larvas para evaluar la virulencia bacteriana

Este video muestra un método para establecer un modelo de infección por Mycobacterium bovis en las larvas de la polilla de la cera mayor, Galleria mellonella. Se inyecta una cepa bioluminiscente de Mycobacterium bovis BCG en la hemolinfa de la larva para establecer la infección, y la bioluminiscencia se mide a intervalos predefinidos para estudiar el progreso de la infección.

Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en larvas de insectos

Este vídeo muestra la medición de la carga bacteriana in vivo utilizando larvas de insectos infectadas con Bacillus Calmette-Guérin, BCG, lux. El proceso implica la homogeneización de las larvas, el tratamiento con un sustrato de luciferasa y la medición de la bioluminiscencia para determinar las unidades de luz relativas que se correlacionan con la carga bacteriana.

Medición de la carga in vivo de bacterias que expresan luciferasa en una larva de insecto

La mosca mediterránea de la fruta (mosca del mediterráneo) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) es una plaga mundial de la agricultura. Una comprensión más profunda de su biología es clave para controlar las poblaciones de moscamed y, por lo tanto, reducir el impacto económico. La microinyección embrionaria es una herramienta fundamental que permite tanto la transformación de la línea germinal como los estudios de genética inversa en esta especie.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Este protocolo describe un calor proteína inducida por choque expresión sistema (pDHsp/V5-su/sf9 de la célula), que puede utilizarse para evaluar la actividad anti-apoptótica de posibles proteínas extrañas y su truncado amino o expresando proteínas extrañas ácidos en las células de los insectos.

Expresión transitoria de Genes foráneos en células de insecto (sf9) para el análisis funcional de proteínas

En este protocolo, baculovirus es producida por transitorios de la transfección del plásmido de baculovirus en células Sf9 y amplificado en una cultura de suspensión libre de suero. El sobrenadante es purificado por cromatografía de afinidad de heparina y más concentrado por ultracentrifugación. Este protocolo es útil para la producción y purificación de baculovirus para el uso de la terapia génica.

Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Aquí, presentamos un protocolo para producir casa mosca carboxilesterasa proteínas en vitro con un sistema de expresión de baculovirus mediada por células de insectos y caracterizar funcionalmente más adelante su papel en la metabolización de permetrina, de tal modo, que confieren piretroides resistencia mediante la realización de celular MTT análisis y en vitro estudios metabólicos.

Caracterización funcional de carboxilesterasas en casa resistente al insecticida moscas, Musca Domestica

Aquí, presentamos los protocolos para la utilización de la célula y baculovirus proteína expresión sistema insecto para producir grandes cantidades de proteínas vegetales segregada para la cristalización de proteínas. Un vector de expresión de baculovirus se ha modificado con GP67 o insectos hemolin péptido señal para la expresión de la secreción de la proteína de planta en células de los insectos.

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

El sistema de vectores de expresión de baculovirus (BEVS) es una plataforma robusta para la detección de expresión y la producción de proteínas arginina metiltransferasas (PRMTs) que se utilizarán para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales. Cantidades de miligramo de material se pueden producir para la mayoría de prmts y otras proteínas de interés que requieren una plataforma de expresión eucariota.

Producción De Proteínas Prmt Recombinantes Utilizando El Sistema De Vectores De Expresión De Baculovirus

Los estudios estructurales y bioquímicos de los transportadores de membrana humana requieren cantidades de miligramos de proteína estable, intacta y homogénea. Aquí describimos métodos escalables para seleccionar, expresar y purificar transportadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones.

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Aprenda técnicas de microaplicador para infectar larvas de lepidópteros con baculovirus mediante inyección directa de virus o inoculación oral de poliedros. Estos métodos permiten evaluar la eficacia insecticida con precisión.

Protocolos para microaplicador, asistida por la infección de las larvas de lepidópteros con Baculovirus

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