Protocolos para microaplicador, asistida por la infección de las larvas de lepidópteros con Baculovirus

Si bien el virus baccala específico del artrópodo se utiliza como una herramienta de investigación estándar para los sistemas de expresión de proteínas eucariotas, también se está desarrollando como un agente insecticida seguro para el medio ambiente, que puede matar insectos herbívoros como los lepidópteros en la naturaleza. Las larvas de lepidópteros se infectan con los virus baccala cuando comen follaje infectado. Las larvas u orugas ingieren el virus baccala en una forma conocida como poliedro, que es un complejo de partículas de virus empaquetadas en una gran estructura de proteína cristalina que protege al virus de la desecación.

Una vez que la larva está infectada, el virus difuminado disemina la infección dentro del insecto. El virus secuestra la maquinaria de síntesis de ácidos nucleicos y proteínas del huésped para producir más virus y poliedros. Eventualmente, las larvas se infectan tan completamente con el virus que se disuelven en un exudado desordenado de poliedros que gotea sobre las superficies de las plantas ingeridas por el insecto, y luego el ciclo comienza de nuevo para determinar la eficacia insecticida de un Baca en particular.

Se pueden combinar las técnicas de microaplicador de cepas Avir y los bioensayos. Las larvas de Leid dorin pueden infectarse mediante la inyección de virus a tope directamente en el HemosIL o en la cavidad corporal y se pueden evaluar las tasas de mortalidad. Además, las larvas pueden infectarse con poliedros mediante inyección oral asistida por microaplicador y se puede analizar el momento de la infección del intestino y otros tejidos.

Hola, soy Wendy Sparks en el laboratorio de Brian e deshuesado en el Departamento de Entomología de la Universidad Estatal de Iowa Y también soy de deshuesado snap. Hoy le mostraremos dos procedimientos para infectar el conducto de laboratorio DI con el virus de la acumulación de trabajo. Ambos métodos utilizan micro aplicador.

En primer lugar, le mostraré el uso de un micro aplicador para administrar el virus del cuerpo en el heni a través de prole. Luego, cuando se muestre, use el micro aplicador para entregar el encabezado de polietileno en la protección media a través del mouse. Así que comencemos.

Cuando se desarrollan con fines insecticidas, los virus balo generalmente contienen el gen del poliedro para facilitar la infección oral de las larvas de plagas. Sin embargo, en ocasiones, hay razones para analizar un virus baccala negativo para poliedros en busca de posibles efectos insecticidas o para evitar el intestino de un insecto. En este caso, se puede realizar la inyección de virus a tope con un microaplicador para infectar las larvas antes de comenzar el ensayo.

El título del material de trabajo del virus a tope debe determinarse mediante ensayo de placa o ensayos de dilución de punto final. Para los experimentos fisiológicos, serían típicas las inyecciones de cinco veces 10 a la cuarta PFU por el quinto estadio H VNS. Para comenzar este bioensayo, cargue cada dilución de virus a tope en una jeringa de plástico de un cc a Hércules con una punta de aguja afilada de calibre 28,5 o 32.

Por lo general, de uno a tres microlitros de solución viral a tope. Con un título de 10 a la séptima, se pueden usar menos 10 a la octava por mililitro para cada larva, de modo que cargar de 300 a 500 microlitros en la jeringa sea suficiente para la mayoría de los propósitos. A continuación, expulse las burbujas de aire de la jeringa sosteniéndola en posición vertical para llevar el aire a la punta de la aguja y dispensarla.

A continuación, fije la jeringa en el tubo de soporte de la jeringa. Ahora ajuste el volumen a 1.0 microlitro. Para cada gota en la unidad de control del microprocesador del microaplicador, calibre primero la unidad de control para asegurarse de que se dispense el volumen correcto, la velocidad con la que se dispensa la gota se puede establecer en una escala de cero a nueve.

Comúnmente se usa un rango de cero a uno. Presione el interruptor de pie para asegurarse de que la solución se dispense correctamente. Recuerde que si se dispensa demasiada solución o si la aplicación es demasiado lenta, los ajustes de volumen y velocidad se pueden ajustar hasta que se aplique el volumen correcto de solución a la tasa correcta.

Ahora estoy listo para comenzar la inyección para la infección por H VNS. Las larvas de quinto estadio temprano generalmente se inyectan, el mayor tamaño de los estadios posteriores facilita el proceso de inyección. Inserte la punta de la aguja a través de la plana de una de las patas profesionales y dentro de la cavidad corporal.

Tenga en cuenta que cuando la punta de la aguja se inserte en el prole, cambie la posición del cuerpo de la larva Para evitar dañar el intestino y la pared corporal, ahora presione el interruptor de pie cuatro veces para administrar cuatro microlitros de la solución viral en el hemosello. Una vez completadas las inyecciones, regrese todas las larvas a la incubadora a 28 grados centígrados. Revise con frecuencia si hay larvas muertas y asegúrese de que haya una dieta adecuada disponible para las larvas sobrevivientes.

A pesar de que los estadios tardíos no mueren por lesiones en la cutícula como resultado de la inyección, las larvas deben ser revisadas 24 horas después de la inyección en caso de daño en el intestino, que podría resultar de una infección bacteriana. Esta mortalidad precoz debe excluirse del análisis de los datos. Si se utiliza el bioensayo asistido por microaplicador con virus a tope para bioensayos de concentración letal, el bioensayo debe replicarse tres o cuatro veces en ocasiones separadas.

Use 30 individuos por dosis para cada virus o tratamiento de control. Utilice un programa de análisis de sucesiones adecuado, como polo o SAS, para calcular los valores de lc 50, los intervalos de confianza del 95% y las estadísticas adecuadas. Este bioensayo también se puede utilizar para determinar los valores de tiempo de supervivencia de ST 50 después de la inoculación de una dosis fija de virus.

En este caso, la mortalidad de las larvas se puntúa cada cuatro a ocho horas con observaciones más frecuentes. Si la tasa de mortalidad es alta, la mediana de los tiempos de supervivencia en los límites de confianza del 95% se calcula utilizando el estimador de Kaplan Meyer utilizando un programa s plus o SAS. Ahora que Harran le ha mostrado el bioensayo asistido por microaplicador utilizando virus a tope.

Te mostraré el ensayo. La inoculación oral de poliedros directamente en el intestino del insecto se utiliza cuando el momento exacto de la infección es crítico. Por ejemplo, al monitorear cómo se disemina el virus dentro del insecto, para comenzar este ensayo, suspenda los poliedros en una solución de tres a dos de glicerina y agua de flotación neutra de 10 a 300.

Los poliedros podrían utilizarse, por ejemplo, para el cuarto estadio. Luego cargue esta solución en una jeringa de tuberculina CC de plástico o vidrio con una aguja de punta roma de calibre 32. Coloque la jeringa en el tubo de soporte del microaplicador mirando hacia abajo de un microscopio.

Sostenga la cuarta o quinta larva en estrella, inserte la aguja a través de la boca y en la región anterior del intestino medio, luego entregue los poliedros. Esta técnica requiere algo de práctica. En primer lugar, puede ser complicado sujetar las larvas con guantes sin aplastarlas.

En segundo lugar, se necesita algo de práctica para mover la aguja más allá de las partes de la boca. Le recomendamos que practique la inoculación de unas 30 larvas con PBS. Si perforas el intestino, será obvio porque las larvas se melancólicos y se vuelven negras con bastante rapidez.

Una vez más, debido a que la inoculación oral asistida por microaplicador proporciona el momento exacto de la infección, este método es más útil para experimentos en los que el tiempo de infección es importante para determinar cómo se propaga el virus dentro del insecto. Por ejemplo, los virus que expresan betagalactosas dase se pueden inocular por vía oral en larvas, que luego se diseccionan en varios puntos de tiempo para determinar qué tejidos se infectan y cuándo. El primero de los cuales fue la inoculación directa a través del pro Legg del virus a tope, y esto le permite evitar la fisiología intestinal y evaluar la letalidad y el tiempo letal del virus que le interesa.

La segunda técnica fue la inoculación directa en el intestino medio mediante poliedros. Esto le permite administrar una dosis muy precisa directamente en el intestino medio, así como controlar el momento muy preciso del evento. De este modo, también se puede estudiar la mortalidad y otros fenotipos del virus.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los cadáveres de las larvas muertas por el virus baula suelen ser frágiles y pueden romperse fácilmente liberando el virus. Por lo tanto, esterilice las superficies de trabajo y deseche los guantes contaminados y los materiales desechables de manera adecuada para evitar la contaminación. Así que eso es todo.

Gracias por mirar. Buena suerte con tu experimento.