Name: Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-27T12:38:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprende a preparar y fraccionar extractos de huevo de Xenopus laevis mediante lisis y centrifugación diferencial. Este método permite obtener fracciones citoplasmáticas y de membrana para estudiar ensamblaje nuclear y replicación del ADN in vitro.

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El protocolo de texto completo de este enfoque experimental está disponible en <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract ]">protocolos actuales en Biología Celular</a> .

Los autores no tienen nada que revelar.

preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo xenopus laevis

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Extractos de Xenopus huevo crudo y fraccionado se puede utilizar para proporcionar ingredientes para la reconstitución de los procesos celulares de análisis morfológicos y bioquímicos. Lisis de huevo y centrifugación diferencial se utilizan para preparar el extracto crudo que a su vez en utilizarse para preparar extractos fraccionados y preparados ligeros membrana.

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

Los extractos crudos y fraccionados de ovocitos de Xenopus pueden utilizarse para proporcionar los componentes necesarios para la reconstitución de procesos celulares con fines morfológicos y bioquímicos...

En un video anterior, demostramos cómo obtener y desjelar huevos de XUS labis maduras. Los extractos crudos de estos huevos proporcionan una fuente útil de material citoplasmático y de orgánulos para la reconstrucción in vitro de eventos celulares como el ensamblaje nuclear, la importación de proteínas nucleares y la replicación del ADN. Hola, me llamo Marie Cross y soy estudiante de posgrado en el laboratorio de la Dra. Maureen Power, del Departamento de Biología Celular de la Universidad de Emory en Atlanta, Georgia.Hoy les mostraremos cómo fraccionar un extracto de huevo en fracciones citoplasmáticas solubles y de membrana ligera. Este procedimiento incluye los siguientes pasos: lisar los huevos, recolectar los extractos crudos, fraccionar los extractos crudos de huevo, recolectar el extracto citoplasmático y recolectar la fracción de membrana ligera del extracto de huevo. Así que comencemos.Comencemos por lisar los huevos y recolectar extractos crudos antes de la lisis de los huevos. Se debe fabricar una pipeta de transferencia rompiendo una pipeta Pasteur e insertando cuidadosamente el extremo roto en una perilla de pipeteo. Transfiera los huevos a un tubo de polipropileno de 15 ml.Se requiere una pipeta de boca ancha para evitar la lisis de los huevos. A continuación, centrifugue los huevos durante 30 segundos en una centrífuga clínica a 400 veces G y elimine el tampón de los huevos desde la parte superior de los huevos sedimentados mediante aspiración.Observe el volumen de los huevos empaquetados. En función de este volumen, agregue una solución de aprotinina y leptina, y luego agregue directamente sobre los huevos la citocina B hasta alcanzar una concentración final de cinco microgramos por mililitro, utilizando soluciones madre de cinco miligramos por mililitro; también agregue ciclohéxido hasta alcanzar una concentración final de 50 microgramos por mililitro, usando una solución madre de 10 miligramos por mililitro. La aprotinina y la leptina inhiben las proteasas.La citoquina B inhibe la polimerización de actina y el cicloheida inhibe la síntesis de proteínas. Ahora lice los huevos mediante centrifugación durante 15 minutos a 12.000 G en el rotor HB cuatro de cubeta oscilante a cuatro grados Celsius. Los huevos lisados se separarán en tres capas.Una capa lipídica amarilla en la parte superior, el extracto crudo en el medio y un sedimento oscuro. Retire el extracto crudo perforando el costado del tubo de polipropileno con una aguja de calibre 18 conectada a una jeringa de tres mililitros. El extracto crudo contiene componentes nucleares y citosólicos, membranas ligeras del retículo endoplásmico, envoltura nuclear, ribosomas y orgánulos de membrana pesada, incluidas mitocondrias.El extracto puede almacenarse de una a dos horas sobre hielo. Acabo de mostrarle cómo obtener un extracto crudo de huevos de opus lavis. Es importante recordar que estos extractos no permitirán el ensamblaje nuclear una vez que se hayan congelado y descongelado, a menos que se hayan fraccionado en las fracciones citoplasmática y de membrana ligera.Le mostraré cómo hacerlo ahora. Para comenzar la fraccionamiento, transfiera el extracto crudo de huevo a un tubo de centrífuga UltraClear de 2,5 mililitros. Centrifugue el extracto de huevo durante 90 minutos en una centrífuga Beckman TLS 100 utilizando un rotor TLS 55 a 55.000 RPM o 250.000 G a cuatro grados Celsius.Tras la centrifugación, el extracto se separará en una fracción soluble clara con una fracción de membranas de color amarillo pálido. Debajo de esta se encontrará una fracción de membranas oscuras compuesta por mitocondrias y otros orgánulos, situada por debajo de las membranas claras. En la parte inferior hay una fracción grande que contiene ribosomas y glucógeno; mantenga el extracto sobre hielo.Retire la fracción soluble clara con una punta de pipeta de 200 microlitros con filtro. Tenga cuidado de no perturbar la capa de membrana ligera, conserve tanto la fracción citoplasmática en la capa de membrana y mantenga todo en hielo. A continuación, centrifugue nuevamente la fracción soluble en un nuevo tubo de centrífuga UltraClear de 2,5 ml durante 25 minutos a 250.000 Gs a cuatro grados Celsius; tras la centrifugación, recoja de nuevo la fracción soluble superior, divídala en alícuotas de cien microlitros, congele las alícuotas en nitrógeno líquido y almacénelas a menos 80 grados Celsius hasta que estén listas para su uso.Ahora demostraré cómo recolectar la fracción de membranas ligeras del extracto de óvulo de opus utilizando una micropipeta con una punta cortada o de gran apertura. Retire cuidadosamente la fracción de membranas ligeras de la capa de membranas, dejando las membranas oscuras sin perturbar. Transfiera las membranas ligeras a un tubo UltraClear de 2.5 ml que contenga 1.5 ml de tampón de lisis de óvulos.Comience a dispersar las membranas y el tampón pipeteando tres veces con una punta de micropipeta de un mil. Luego, sostenga el perfil sobre la parte superior del tubo e inviértalo varias veces para completar suavemente la dispersión de las membranas en el tampón. A continuación, subyaga las membranas con tampón de lisis de huevo con sacarosa al 2x liberándolo desde una pipeta Pasteur en la parte inferior del tubo que contiene las membranas.Agregue suficiente tampón para llenar el tubo. Se observará fácilmente una capa clara debajo de las membranas. El tampón de lisis de huevo al sacarosa al doble actúa como un cojín para eliminar cualquier proteína asociada periférica o no específicamente con las membranas. Centrifugue durante 20 minutos a 25.000 Gs en el rotor TLS 55 a cuatro grados Celsius.Después de la centrifugación, la membrana estará en un sedimento amarillo suelto en el fondo del tubo; retire con pipeta el tampón claro hasta que solo quede la fracción de membrana en el tubo, utilizando una punta de pipeta de gran orificio. Recolecte la membrana y distribúyala en alícuotas, luego congélela rápidamente en nitrógeno líquido y almacénela a menos 80 grados Celsius. Ahora, estas fracciones pueden utilizarse para diversos fines, incluyendo la formación de núcleos.In vitro. Acabamos de mostrarle cómo preparar un extracto crudo a partir de huevos de Xenopus laevis y cómo fraccionarlos en fracciones citoplasmática y de membranas ligeras; cualquiera de los dos, ya sea el extracto crudo recién preparado o las fracciones solubles congeladas más la fracción de membranas ligeras, puede utilizarse para el ensamblaje nuclear in vitro. Consulte nuestro otro video en el que demostramos el ensamblaje nuclear in vitro en estos extractos.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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Investigación

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Biología

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Estudio del Checkpoint Daño del ADN utilizando<em&gt; Xenopus</em&gt; Extractos de huevo

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La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

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Un ensayo libre de células Utilizando<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrión Extrae para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear

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Describimos un método para la preparación y obtención de imágenes en vivo de extractos citoplasmáticos sin diluir de huevos de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica

Aprende a preparar y fraccionar extractos de huevo de Xenopus laevis mediante lisis y centrifugación diferencial. Este método permite obtener fracciones citoplasmáticas y de membrana para estudiar ensamblaje nuclear y replicación del ADN in vitro.

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

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