No específico de Sigma Ensayo de actividad de la proteasa - La caseína como sustrato

Las proteasas rompen los enlaces peptídicos en el laboratorio. A menudo es necesario medir o comparar la actividad de las proteasas de Sigma. El ensayo universal de actividad proteásica puede utilizarse como un procedimiento estandarizado para determinar la actividad de las proteasas, lo cual es lo que hacemos durante nuestros procedimientos de control de calidad.

En este ensayo, la casiana actúa como sustrato cuando la proteasa que estamos probando digiere la casiana. Se libera el aminoácido tirosina junto con otros aminoácidos y fragmentos peptídicos. La tirosina libre reacciona entonces con el reactivo de Folin-Ciocalteu o reactivo de Folin para producir un cromóforo de color azul, que es cuantificable y se mide como un valor de absorbancia en el espectrofotómetro.

Cuanta más tirosina se libere de la caseína, mayor será la generación de cromóforos y más intensa será la actividad de la proteasa. Los valores de absorbancia generados por la actividad de la proteasa se comparan con una curva patrón, que se obtiene al hacer reaccionar cantidades conocidas de tirosina con el reactivo FC para correlacionar los cambios en la absorbancia. A partir de la cantidad de tirosina en micromoles obtenida mediante la curva patrón, se puede determinar la actividad de las muestras de proteasa en unidades, que corresponden a la cantidad de micromoles de equivalente de tirosina liberados de la caseína por minuto. Hola, mi nombre es Carrie Cup Vineyard y soy científica en nuestras instalaciones Sigma Aldridge DeKalb aquí en St. Louis, Missouri.

Hoy, les mostraré un método universalmente aplicable para evaluar la actividad de proteasas en Sigma Aldridge. Utilizamos principalmente este ensayo en nuestra área de control de calidad para asegurarnos de que nuestra proteasa tenga actividad suficiente antes de enviarla directamente a su laboratorio. Antes de comenzar el ensayo, debemos asegurarnos de que los siguientes reactivos estén correctamente preparados.

Un tampón de fosfato de potasio 50 milimolar, pH 7,5. La solución se coloca a 37 grados Celsius antes de usar. Una solución de kasian al 0,65 % peso/volumen, preparada mezclando 6,5 miligramos por mililitro en un litro. La temperatura de la solución se incrementa gradualmente con agitación suave hasta 80-85 grados Celsius durante aproximadamente 10 minutos, hasta lograr una dispersión homogénea.

Es muy importante no hervir la solución. Luego, si es necesario, se ajusta el pH con hidróxido de sodio y ácido clorhídrico. Una solución de ácido tricloroacético 110 milimolar preparada diluyendo un stock 6,1 normal en una proporción de uno a 55 con agua purificada 0,5 milimolar, calts fenólicos precipitados o reactivo fenólico precipitado, que es la solución que reaccionará con la tirosina para generar un cambio de color medible.

Esto estará directamente relacionado con la actividad de las proteasas. Una solución de carbonato de sodio 500 milimolar preparada con 53 miligramos por mililitro de carbonato de sodio anhidro en agua purificada, y una solución diluyente de enzima, que consiste en un tampón de acetato de sodio 10 milimolar con calcio 5 milimolar pH 7,5 a 37 grados Celsius. Esta solución es la que utilizamos para disolver muestras sólidas de proteasa o diluir soluciones enzimáticas.

La solución stock estándar de L-tirosina, que debe tener una concentración inicial de 1,1 milimolar, una solución de 0,2 miligramos por mililitro de L-tirosina, se prepara en agua purificada y se calienta suavemente hasta que la tirosina se disuelve. Al igual que con la casiana, no hierva esta solución. Deje que la solución estándar de L-tirosina se enfríe a temperatura ambiente.

Esta solución se diluirá aún más para elaborar nuestra curva patrón, si es necesario, utilizando una muestra sólida de proteasa con actividad predeterminada, que se disuelve en diluyente de enzima hasta alcanzar de 0,1 a 0,2 unidades por mililitro. Esta solución sirve como control positivo para el ensayo de control de calidad y como validación para los cálculos que realizaremos para determinar la actividad enzimática. Ahora que hemos preparado nuestros reactivos y todos están a la temperatura correcta, comenzaremos nuestro ensayo de proteasa.

Para comenzar este ensayo, busque viales adecuados que puedan contener aproximadamente 15 mililitros. Para cada enzima que vaya a probar, necesitará cuatro viales. Un vial se utilizará como blanco, y otros tres se emplearán para evaluar la actividad de tres.

La dilución de la proteasa en tres diluciones es útil al verificar nuestros cálculos finales entre sí; agregue a cada conjunto de cuatro viales cinco mililitros de nuestra solución al 0,65 % de kasiana y déjelos equilibrar en un baño de agua a 37 grados Celsius durante aproximadamente cinco minutos. Luego añada concentraciones variables de nuestra solución de enzima a tres de los viales de muestra, pero no al blanco. Mézclelos agitando suavemente y incube a 37 grados Celsius durante exactamente 10 minutos.

La actividad de la proteasa y la liberación consiguiente de tirosina durante este tiempo de incubación es lo que se medirá y comparará entre nuestras muestras de prueba. Después de esta incubación de 10 minutos, agregue cinco mililitros del reactivo de TCA a cada tubo. Luego se añade un volumen apropiado de solución enzimática a cada tubo, incluso al blanco, de modo que el volumen final de la solución enzimática en cada tubo sea de un mililitro.

Esto se hace para tener en cuenta el valor de absorbancia de la enzima misma. Ahora incube las soluciones a 30 grados Celsius durante 30 minutos. Durante esta incubación de 30 minutos, es posible que desee preparar las diluciones del estándar de tirosina, lo cual se realiza utilizando seis viales DR.

Esto puede contener fácilmente ocho mililitros en los seis viales. Se añade la solución patrón de tirosina 1,1 milimolar con los siguientes volúmenes en mililitros: 0,05, 0,1, 0,2, 0,4 y 0,5. No añada ninguna solución patrón de tirosina al blanco.

Pueden ser necesarios estándares más bajos para muestras de prueba de IPU que produzcan un cambio de color mínimo. Una vez que se ha agregado la solución estándar de tirosina, añada un volumen apropiado de agua purificada a cada uno de los estándares para llevar el volumen a dos mililitros. Después de la incubación, filtre cada una de las soluciones de prueba y la muestra en blanco.

Utilizando un filtro de jeringa de 0,45 micrones, se añaden entonces dos mililitros de las muestras de ensayo y del filtrado en blanco a cuatro viales DR que pueden contener al menos ocho mililitros. Puede utilizarse el mismo tipo de vial en el que se prepararon los patrones; a todos los viales que contienen los patrones y el blanco patrón se añaden cinco mililitros de carbonato de sodio, y para obtener los mejores resultados, se añade inmediatamente después el reactivo precipitado; luego se añade carbonato de sodio a nuestras muestras de ensayo y al blanco de ensayo. Observará que estas soluciones se vuelven turbias tras la adición de carbonato de sodio.

Luego se añade el reactivo caído, que reaccionará con la tirosina libre. A continuación, se mezclan los viales DRAM mediante agitación suave y se incuban a 37 grados Celsius durante 30 minutos tras esta incubación. Debería observarse que los patrones presentan una gradación de color que se correlaciona con la cantidad de tirosina añadida, apareciendo las concentraciones más altas de tirosina con el color más oscuro.

También puede observarse un cambio de color apreciable en nuestras muestras de prueba. Se filtran dos mililitros de estas soluciones utilizando un filtro de jeringa de 0,45 micrones y cubetas adecuadas. Ahora que hemos finalizado nuestro ensayo, procedamos al espectrofotómetro y registremos nuestros valores de absorbancia.

La absorbancia de nuestras muestras se mide mediante un espectrofotómetro utilizando una longitud de onda de 660 nanómetros. La trayectoria de la luz se ajusta a un centímetro; registre los valores de absorbancia para el blanco del patrón, las diferentes muestras de ensayo y el blanco de ensayo. Una vez que se han recopilado todos los datos, estamos listos para crear nuestra curva patrón.

Para generar la curva, se debe calcular la diferencia de absorbancia entre el estándar y el blanco del estándar. Este es el valor de absorbancia atribuible a la cantidad de tirosina en las soluciones estándar. Después del cálculo simple, creamos nuestra curva patrón graficando el cambio en absorbancia de nuestros estándares en el eje Y frente a la cantidad en micromoles de cada uno de nuestros cinco estándares en el eje X.

Una vez que hayamos ingresado nuestros puntos de datos y generado una línea de mejor ajuste, determinamos el cambio en la absorbancia de nuestras muestras de prueba calculando la diferencia entre la absorbancia de la muestra de prueba y la absorbancia del blanco de prueba. Observando nuestra curva patrón, identificamos el valor de absorbancia de una de nuestras muestras de prueba en el eje Y. A continuación, trazamos una línea paralela al eje X y nos detenemos en el punto donde intersecta nuestra curva patrón.

Luego, a partir de la coordenada X tomada en este punto, obtenemos la cantidad en micro moles de tirosina liberada durante esta reacción proteolítica particular. Para obtener la actividad de la enzima en unidades por mililitro, realice el siguiente cálculo: tome el número de micro moles de equivalentes de tirosina liberados, obtenido a partir de la curva patrón, y multiplíquelo por el volumen total del ensayo en mililitros, que en nuestro caso es de 11 mililitros. Luego divida este valor por otras tres cantidades.

El tiempo del ensayo, que realizamos durante 10 minutos, el volumen de enzima utilizado en el ensayo, que se varió. Utilicemos un mililitro. El volumen de mililitros empleado en la detección clorométrica, que puede diferir según su Q vet.

Utilizamos dos mililitros. Los micromoles de tirosina divididos por el tiempo en minutos nos dan nuestra medida de actividad de proteasa que denominamos unidades. Podemos cancelar las unidades de medida de volumen en el numerador y el denominador y, por lo tanto, quedamos con una medida de actividad enzimática en términos de unidades por mililitro.

Con el fin de determinar la actividad en una muestra sólida de proteasa diluida en diluyente de enzima, dividimos nuestra actividad en unidades por mililitro entre la concentración del sólido utilizado originalmente en este ensayo en miligramos por mililitro, lo que nos deja con la actividad en términos de unidades por miligramo. Acabamos de mostrarle cómo analizar la actividad de la proteasa utilizando el ensayo universal de actividad de proteasa de Sigma. Como ha podido observar al realizar este procedimiento, es fundamental recordar calentar lentamente tanto las soluciones de caseína como de tirosina, y no hervirlas.

Además, es fundamental preparar diferentes blancos tanto para sus estándares como para cada muestra de prueba que tenga. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus actividades de proteasas.