Utilizando pinzas láser para manipular neuronas aisladas in vitro
11 de septiembre de 2008
Este video describe la manipulación de cultivos de neuronas con pinzas láser in vitro.
Ashkin fue el primero en demostrar que las pinzas láser o trampas ópticas son una herramienta poderosa para manipular objetos vivos microscópicos micronizados. En este video, mostraremos cómo hemos aplicado esta tecnología para capturar y mover neuronas. Esta es la estación de trabajo de pinzas ópticas.
Las flechas verdes muestran el trayecto seguido por el haz láser a través de la óptica del microscopio. Cuando un haz láser enfocado por la lente del objetivo del microscopio se refracta al pasar por una célula, la fuerza que cambia la dirección del rayo de luz actúa sobre la célula, moviéndola hacia el centro de enfoque.
Esto genera newtons de Pika de fuerza suficiente para arrastrar una célula a través del medio. En este video, hablaremos sobre la fabricación de placas, la preparación de células retinianas, el sembrado de células en placas de cultivo, la manipulación con pinzas láser y la observación del crecimiento celular. Dado que las células se adhieren al vidrio, necesitábamos crear un área repelente para células donde pudieran atraparse fácilmente con las pinzas.
La mitad del platillo fue recubierta con poli-HEMA, un polímero repelente de células. La otra mitad fue recubierta con CellOne, un sustrato que favorece el crecimiento de nuestras células. Primero, se identifica una célula en el lado del platillo adhesivo para células.
Luego, se atrapa otra célula en el lado del polímero y se transporta al lado adhesivo, donde se emparejan ambas células. Para preparar los recipientes, utilizamos platos de cultivo esterilizados de poliestireno soplado, de 35 milímetros. Primero, hacemos un orificio de un centímetro de diámetro en la base con un torno pequeño o una taladradora.
Tome cubreobjetos limpios con ácido y colóquelos en posición vertical en un ambiente libre de polvo, como una campana. Tome la solución de poli-HEMA disuelta en alcohol al 95 % y coloque unas gotas cerca de la parte superior del cubreobjetos, solo en una mitad. Deje secar el poli-HEMA. Marque el lado del cubreobjetos con poli-HEMA.
Coloque la S guardia alrededor del orificio en la parte inferior del plato de cultivo. Pegue el cubreobjetos al plato con la S guardia. Asegúrese de que el poliamida esté en el interior y también verifique que no haya fugas a través de los espacios en la guardia del umbral.
Coloque el cubreobjetos de manera que el borde del recubrimiento de poli-hema recorra el centro del recipiente. Deje secar el recipiente durante dos o tres días, y luego raye el fondo del recipiente con un bolígrafo de punta de diamante, haciendo marcas que servirán como puntos de referencia para posicionar el recipiente en la platina del microscopio. Coloque los recipientes en la cabina y esterilícelos bajo luz ultravioleta.
Coloque una o dos gotas de solución de anticuerpo de cabra anti-US en el lado no poliar del recipiente, teniendo cuidado de no derramarlo sobre el recubrimiento de polihémico y déjelo durante aproximadamente tres horas. Retírelo y lávelo con solución salina estéril. Coloque la solución del anticuerpo primario celular en la misma zona e incube durante la noche, listo para el experimento al día siguiente.
Las células en nuestro laboratorio se derivan de retinas de salamandras en fase acuática adulta. Las retinas se diseccionan y extraen, y luego se digieren con enzima. A continuación, el cultivo puede sembrarse con células aisladas.
Se extraen los ojos. Se disecciona y se elimina la córnea. La copa del ojo se coloca en solución de Ringer estéril.
La retina se separa de la copa ocular extrayéndola con el borde de una pinza curva. Se burbujea dióxido de carbono y oxígeno en una solución de Ringer que contiene propano y luego se esteriliza mediante un filtro ultrafino de 0,2 micrones. Las retinas se colocan en la solución enzimática y se digieren durante aproximadamente 40 minutos con agitación para desagregar el tejido.
Después de lavar tres veces, las retinas se disocian mediante tri. Utilizando una pipeta de bola de tres milímetros, las células aisladas están listas para sembrarse antes del sembrado. El plato de cultivo que contiene el medio se coloca sobre la platina del microscopio y se orienta adecuadamente utilizando las marcas de rayado en la parte inferior del plato.
Esto permite duplicar la posición exacta del plato en un momento posterior. A continuación, las células se siembran tanto en el poli hema como en los dos lados celulares del plato. La posición del plato sobre la platina del microscopio, así como la potencia del láser, se controlan mediante la palanca de mando.
Primero, identificamos una célula adherida a un lado de la placa. Esta es una célula multipolar retiniana identificable por sus dendritas. Se guarda la coordenada de la posición de la célula.
Esta es una célula fotorreceptora de bastón en el lado del recipiente que repele la célula poliolar. El recipiente se baja y la célula es capturada por el láser y elevada lejos del fondo del recipiente. Ahora la célula está siendo transportada al otro lado del recipiente, hacia las coordenadas de la célula multipolar.
En realidad, la célula está estacionaria. Es el recipiente el que se mueve. Ahora la célula está pasando por el borde del recubrimiento de poli hemo.
La protuberancia que se extiende desde la célula es el terminal axónico. La célula está bien separada de cualquier detrito y otras células en el fondo del recipiente, que podrían obstaculizar su movimiento. Las imágenes desenfocadas de las células en el fondo del recipiente son visibles en el fondo.
La célula en bastón llega a la célula multipolar y puede posicionarse con precisión en el punto deseado y a la distancia deseada de esa célula. El recipiente se eleva y la célula se adhiere a un sustrato celular. Las principales ventajas de este procedimiento son que se puede elegir qué células mover y que las manipulaciones pueden realizarse en un experimento estéril cerrado.
Las interacciones entre célula y célula pueden monitorizarse mediante lapso de tiempo en video o mediante fotografía digital. Las pinzas láser pueden utilizarse con cualquier técnica biológica. Aquí, por ejemplo, una técnica de fluorescencia demuestra la presencia de proteínas sinápticas en los puntos de conexión entre células movidas por las pinzas.
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Resumen
Este video describe la manipulación de neuronas cultivadas utilizando pinzas láser in vitro. Se muestra que las pinzas láser son una herramienta potente para capturar y mover neuronas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Manipulación óptica
- Biología celular
Antecedentes
- Las pinzas láser fueron demostradas por primera vez por Ashkin como un método para manipular objetos vivos microscópicos.
- Esta tecnología permite un control preciso de los movimientos celulares.
- Comprender la manipulación de neuronas puede ayudar en diversas aplicaciones de investigación en neurociencia.
- Las trampas ópticas utilizan haces láser enfocados para ejercer fuerzas sobre las células.
Objetivo del estudio
- Demostrar la aplicación de las pinzas láser en la manipulación neuronal.
- Ilustrar la mecánica del atrapamiento óptico en un contexto biológico.
- Proporcionar información sobre los usos potenciales de esta tecnología en la investigación en neurociencia.
Métodos Utilizados
- Uso de pinzas láser para manipular neuronas cultivadas.
- Observación de la interacción entre la luz láser y las células neuronales.
- Utilización de un microscopio para enfocar el haz láser.
- Demuestra el movimiento de las neuronas hacia el centro de enfoque.
Resultados principales
- Captura y movimiento exitosos de neuronas utilizando pinzas láser.
- Representación visual del trayecto del haz láser a través de la óptica del microscopio.
- Exposición de las fuerzas que actúan sobre las células debido a la refracción láser.
- Ilustración de la eficacia de las trampas ópticas en la investigación biológica.
Conclusiones
- Las pinzas láser son eficaces para manipular neuronas in vitro.
- Esta técnica puede mejorar nuestra comprensión del comportamiento neuronal.
- Aplicaciones adicionales de las pinzas láser podrían avanzar la investigación en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los pinzas láser permiten la manipulación precisa y sin contacto de neuronas individuales in vitro, lo que favorece estudios mecanicistas de la conectividad sináptica y el crecimiento de neuritas. Esta capacidad mejora la validación de objetivos al permitir la interrogación controlada de las interacciones entre células en un entorno estéril y observable. El método proporciona un control espacial cuantitativo útil para reducir los riesgos de las hipótesis en las fases iniciales del descubrimiento en neurociencia.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas mediante el control de la orientación de los neuritos y la selección de socios sinápticos.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de los objetivos neuronales mediante la observación directa de la extensión de los procesos y la adhesión.
- Valor predictivo: Reduce la ambigüedad mecanicista en la elucidación de vías al aislar los comportamientos de los neuritos dependientes de variables.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara pares neuronales estandarizados para la evaluación consistente de moléculas de adhesión o señales de orientación.
- Valor operativo: Permite un sembrado y posicionamiento reproducibles sobre sustratos adhesivos/repelentes definidos, garantizando la uniformidad del ensayo.
- Escalabilidad: Facilita la formación de grupos celulares definidos para lecturas multiparamétricas en formatos de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Apoya la modelización relacionada con enfermedades al permitir la reconstrucción controlada de circuitos neuronales retinianos.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Permite probar moléculas de orientación o sustratos de adhesión en pares aislados de neuritas antes de realizar estudios en redes complejas.
- Confianza Predictiva: Proporciona datos con resolución espacial para informar modelos de interacción con dianas en neurodegeneración o regeneración.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Las pinzas láser se integran en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la manipulación guiada por hipótesis de neuronas aisladas antes del cribado de compuestos o del perfilado fenotípico.
- Biología del Descubrimiento: Facilita el aislamiento de variables en ensayos de crecimiento de neuritas y formación sináptica.
- Cribado: Genera configuraciones neuronales estandarizadas para una exposición y lectura consistentes a compuestos.
- Análisis: Permite mediciones morfométricas y basadas en fluorescencia precisas a distancias intercelulares definidas.
- Investigación Traducional: Se conecta con modelos preclínicos mediante la recreación controlada de patrones de adyacencia de células retinianas.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para la manipulación de neuritas en múltiples campañas de validación de objetivos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los mecanismos diana al reducir el ruido proveniente de interacciones celulares no controladas.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante la fabricación estandarizada de placas y el posicionamiento controlado por láser.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia directa de los comportamientos de neuritas mediados por el blanco.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en fenotipos de interacción validados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en atrapamiento óptico, cultivo neuronal y técnicas microquirúrgicas estériles.
- Depende de una estación de pinzas láser, microscopio invertido y herramientas para la fabricación de placas de cultivo.
- Necesita la estandarización del trazado del sustrato (por ejemplo, Sal-1 frente a poli-HEMA) entre diferentes equipos para garantizar la comparabilidad de los datos.
- La adaptación a otros tipos neuronales requiere la validación de la compatibilidad de adhesión y la eficiencia del atrapamiento.
- Limitado por el rendimiento en cribados a gran escala, pero adecuado para estudios mecanicistas posteriores y la validación de resultados positivos.
