Name: El estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Aprende a analizar la expresión génica inducida por fagocitosis mediante un ensayo de luciferasa Dual-Glo en células HEK293. Este método permite estudiar la biogénesis de membrana y la regulación de vías de síntesis lipídica.

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Cultivo de células <ol><li> Las cepas de riñón embrionario humano 293 (HEK293) células se cultivan en 10 cm de placas de cultivo en el &quot;medio A &#39;, que consiste en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) complementado con un cóctel de antibióticos (100 unidades por ml de penicilina y g 100 por ml de sulfato de estreptomicina) y el 10% de suero fetal bovino (FBS). </li><li> Para configurar las células de un experimento, el medio se aspira y se lavan las células dos veces con 5 ml de tampón fosfato salino (PBS). </li><li> El PBS se retira y se reemplaza con 0,6 ml de una solución que contiene 0,25% de tripsina. </li><li> El plato se incuba a 37 ˚ C durante unos 2 minutos hasta que las células han comenzado a separar. </li><li> 5,5 ml de medio de A es para neutralizar la tripsina y las células se contó con un hemocitómetro. </li><li> Las células se diluyen a 320.000 células por ml y se distribuye a 0,1 ml por pocillo en una polilisina recubiertos de 96 y placa de cultivo. </li><li> Coloque el plato en un cultivo de tejidos incubadora a 37 ˚ C con una atmósfera con CO2 un 8,8% y crecer durante 24 horas. </li></ol> Transfecciones <ol><li> En la preparación para la transfección, se debe considerar el número de repeticiones se van a realizar por las condiciones experimentales y qué cantidades de plásmido se transfectadas ser. En forma rutinaria realizar todas las condiciones, por triplicado, y transfectar un total de 50 a 100 ng de ADN de plásmido por pozo. Mezcla plásmido debe incluir al menos un reportero construir expresar luciferasa de luciérnaga y un plásmido de control luciferasa Renilla expresión de un promotor constitutivo. </li><li> Soluciones de plásmido se pipeta en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y se complementa con 10 l por muestra de suero libre de antibióticos y de libre DMEM. Por ejemplo, si 20 pozos son cada uno para ser transfectadas con el ADN de 50 mg, añadir 200 l DMEM al ADN mg 1. </li><li> A la solución de DMEM / ADN añadir 3 l &#39;Transit 293 reactivos (Mirus) por ADN mg. Mezclar pipeteando arriba y abajo y dejar que las muestras a temperatura ambiente durante al menos 10 min. </li><li> Durante este período, retire el soporte de la placa de 96 pocillos cultura y reemplazar con 90 l de medio fresco A. </li><li> A cada pocillo añadir 10 l de la DMEM / ADN / Tránsito 293 mezcla. </li><li> Coloque el plato en un cultivo de tejidos incubadora a 37 ˚ C con una atmósfera con CO2 un 8,8% y crecer durante 24 horas. </li></ol> Fagocitosis <ol><li> Preparar las suspensiones que contienen medio B (una mezcla 1:1 de DMEM y Ham F12 más antibióticos y un 10% FBS) más de 0,75 m perlas de látex en el cero a 1 mg por ml. </li><li> Retire el papel de la placa de 96 pocillos cultura y reemplazar con 0,1 ml de suspensiones de cuentas en el medio B. </li><li> Girar la placa durante 2 min a 1000 x g. </li><li> Las células se cultivaron a 37 ˚ C durante 6 a 16 hrs. Dependiendo de las condiciones y el promotor utilizado para dirigir la expresión de luciferasa, el aumento de gen reportero puede ser detectada después de 1 a 3 horas. </li><li> En los mismos casos puede ser necesario para la incubación de las células con perlas de 30 a 60 minutos, y luego hacer dos lavados con PBS para eliminar las perlas no incorporadas, y añadir medio fresco antes de incubar las células durante períodos de tiempo adicional. </li></ol> Doble GloTM ensayo Luciferase <ol><li> Nota: el protocolo para el uso de este kit es diferente en algunos aspectos de la recomendada por el fabricante. Se ha modificado para reducir la cantidad de reactivos necesarios por muestra. </li><li> Prepare una solución de 1 M de TDT, se dividen en varias pequeñas alícuotas y guardar a -20 ˚ C. </li><li> Prepare una solución amortiguadora de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), el 10% (v / v) de glicerol, y el 0,5% (v / v) de Triton X-100. Antes de su uso, una parte alícuota de la cantidad necesaria para el experimento y añadir 1 l por ml de 1 M de TDT más cóctel inhibidor de la proteasa a una concentración final de 0,5 a 1x. No vuelva a utilizar la solución remanente de la TDT. </li><li> Cuando se utiliza el kit de doble GloTM por primera vez, preparar el reactivo (luciérnaga) luciferasa mediante la transferencia de todo el contenido de un frasco de tampón luciferasa Dual-GloTM (suministrado con el kit) a una botella de sustrato luciferasa Dual-GloTM (siempre con el kit). Divide el reactivo utilizado luciferasa en 10 ml de alícuotas y guardar a -20 ˚ C. </li><li> Retire la placa de 96 pozos de la incubadora de cultivo de tejido y colocarlo sobre hielo. Retire el papel por aspiración, añadir 40 l por pocillo de tampón de lisis, y luego dejar la placa en hielo durante 30 min. </li><li> En un color blanco opaco, placa de 96 pocillos (OptiplateTM-96, Perkin Elmer número de catálogo 6005290) alícuota de 15 l por pocillo de reactivo de luciferasa, a continuación, añadir 15 l de lisado celular. </li><li> Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego leer la luminiscencia en un lector de microplacas. </li><li> Inmediatamente antes de su uso, prepare una cantidad apropiada de solución de sustrato de luciferasa Renilla mediante la adición de una parte de doble GloTM Stop &amp; Glo ®; Reactivo (suministrado con el kit) a 100 partes de doble GloTM Stop &amp; Glo ® Buffer (suministrado con el kit). </li><li> A cada pocillo añadir 15 l por pocillo de la solución de sustrato de luciferasa Renilla, incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego medir la luminiscencia de nuevo. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

el estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Para el estudio de la coordinación de las diferentes vías de síntesis de lípidos en la biogénesis de la membrana es muy útil para trabajar con un sistema experimental en la biogénesis de la membrana se produce rápidamente y de forma inducible. Hemos encontrado que la fagocitosis de perlas de látex es práctica para estos fines, como las células de rápido sintetizar lípidos de membrana para llenar piscinas membrana perdido como el material de envoltura en inmersión de las partículas. Aquí se describen los procedimientos para el estudio de los cambios en la fagocitosis inducida por la expresión de genes con un enfoque de luciferasa basado en genes utilizando el sistema de doble Glo Luciferase Assay de Promega.

Aquí se describen los procedimientos para el estudio de los cambios en la fagocitosis inducida por la expresión de genes con un enfoque de luciferasa basado en genes utilizando el sistema de doble GloTM ensayo luciferasa de Promega.

El estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes

Para estudiar la coordinación de las diferentes vías de síntesis de lípidos durante la biogénesis de membranas, resulta útil trabajar con un sistema experimental donde la membrana...

Hola, soy IL OV y estudio la coordinación de diferentes vías de síntesis de lípidos en relación con la memoria y la biogénesis. Es útil contar con un sistema experimental en el que la biogénesis de membranas ocurra rápidamente y sea inducible. Descubrimos que la fagocitosis de partículas de látex es particularmente útil para estos estudios, porque las células sintetizan muy rápidamente membranas nuevas para reponer aquellas que se perdieron como material envolvente al principio del proceso de ingestión.En este video, mi colega Ong Zang demostrará los procedimientos utilizados para estudiar los cambios inducidos por la fagocitosis en la expresión génica mediante un ensayo de reportero basado en la luciferasa I, donde, hola, soy X del grupo de exon North del Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de Harvard. Hoy les mostraré cómo utilizar un ensayo de gen reportero para analizar la regulación de genes implicados en la biogénesis de membranas tras la fagocitosis. Comencemos.Para este procedimiento, utilizamos cultivos de células 293 de riñón embrionario humano. Estas células se cultivan en placas de 10 centímetros de diámetro en medio A, que consiste en el medi

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Con el creciente interés en terapias con células madre, las técnicas de imagen molecular son ideales para el comportamiento de las células madre de seguimiento tras el trasplante. Genes luciferase reportero le han permitido no invasiva, la evaluación repetida de la supervivencia celular, la ubicación y la proliferación in vivo. Este vídeo demuestra cómo realizar el seguimiento proliferación de células madre en un ratón vivo.

In vitro e in vivo de imágenes de bioluminiscencia gen reportero de células estaminales embrionarias humanas

Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.

Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

El video muestra el ensayo de luciferasa utilizado para cuantificar proteínas marcadas con luciferasa. El ensayo utiliza una enzima luciferasa modificada genéticamente compuesta por un fragmento grande que se une con el fragmento pequeño, que se conjuga con una proteína de interés. Las subunidades unidas forman una enzima activa que, en presencia del sustrato, libera una señal luminiscente. A continuación, esta señal se cuantifica mediante un luminómetro.

El ensayo de luciferasa: un ensayo de alto rendimiento para medir señales luminiscentes utilizando bioreporteros basados en sistemas de nanoluciferasa de ingeniería

Este video muestra el ensayo de complementación de luciferasa dividida para detectar interacciones proteína-proteína. En este ensayo, las proteínas de interés se marcan con fragmentos pequeños y grandes de la enzima luciferasa. Cuando las proteínas interactúan, los fragmentos grandes y pequeños se combinan para formar un complejo enzimático activo, que en presencia de un sustrato específico, libera una luminiscencia brillante que se puede medir.

Ensayo de complementación de luciferasa dividida para identificar interacciones específicas proteína-proteína

Se presenta un método de diagnóstico rápido y de bajo costo para la identificación de los reguladores transcripcionales utilizando alto rendimiento transfecciones robóticos y un ensayo de luciferasa dual brillo casero. Este protocolo genera rápidamente datos funcionales directos de lado a lado para miles de genes y es fácilmente modificable para apuntar cualquier gen de interés.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.

Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

Se presenta un ensayo de bioluminiscencia en vitro para determinar del ritmo circadiano celular en células epiteliales mamarias. Este método utiliza plásmidos de reportero de células de mamífero expresando desestabilizada luciferasa bajo el control del promotor del gen de periodo 2 . Puede ser adaptado a otros tipos de células para evaluar efectos de órgano-específicas en el ritmo circadiano.

In Vitro Ensayo de bioluminiscencia para la caracterización del ritmo circadiano en células epiteliales mamarias

Luciferase genéticamente codificado es un popular reportero no invasivo de la expresión génica. Uso de un automatizado luciferase longitudinal imagen optimizada de gas y temperatura grabadora (cocodrilo) permite la grabación longitudinal de células bioluminiscentes bajo una amplia gama de condiciones. Aquí mostramos cómo cocodrilo puede utilizarse en el contexto de la investigación de los ritmos circadianos.

Medida flexible de reporteros bioluminiscentes con un automatizado Luciferase Longitudinal imagen optimizada de Gas y temperatura grabadora (cocodrilo)

Células neurales del tallo/progenitor exhiben varias dinámicas de expresión de los componentes de señalización de la muesca que conducen a diferentes resultados de los eventos celulares. Dicha expresión dinámica puede revelarse mediante monitoreo en tiempo real, no mediante análisis estáticos, utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia altamente sensible que permite la visualización de cambios rápidos en expresiones génicas.

Imágenes de bioluminiscencia en tiempo real de la dinámica de señalización de muesca durante la neurogénesis de la murino

Desarrollamos un ensayo informador de biogénesis de microARN intrónico para ser utilizado en células in vitro con cuatro plásmidos: uno con miARN intrónico, uno con el objetivo, uno para sobreexpresar una proteína reguladora y uno para Renilla luciferasa. El miARN se procesó y pudo controlar la expresión de luciferasa uniéndose a la secuencia objetivo.

Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos

Los ritmos circadianos, que existen en la mayoría de los organismos, regulan la organización temporal de los procesos biológicos. Los organoides 3D han surgido recientemente como un modelo in vitro fisiológicamente relevante. Este protocolo describe el uso de reporteros bioluminiscentes para observar los ritmos circadianos en organoides, lo que permite investigaciones in vitro de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares.

Monitorización de las oscilaciones circadianas con un indicador de bioluminiscencia en organoides

Aprende a analizar la expresión génica inducida por fagocitosis mediante un ensayo de luciferasa Dual-Glo en células HEK293. Este método permite estudiar la biogénesis de membrana y la regulación de vías de síntesis lipídica.

El estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes

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