Name: El estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Aprende a analizar la expresión génica inducida por fagocitosis mediante un ensayo de luciferasa Dual-Glo en células HEK293. Este método permite estudiar la biogénesis de membrana y la regulación de vías de síntesis lipídica.

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Cultivo de células <ol><li> Las cepas de riñón embrionario humano 293 (HEK293) células se cultivan en 10 cm de placas de cultivo en el &quot;medio A &#39;, que consiste en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) complementado con un cóctel de antibióticos (100 unidades por ml de penicilina y g 100 por ml de sulfato de estreptomicina) y el 10% de suero fetal bovino (FBS). </li><li> Para configurar las células de un experimento, el medio se aspira y se lavan las células dos veces con 5 ml de tampón fosfato salino (PBS). </li><li> El PBS se retira y se reemplaza con 0,6 ml de una solución que contiene 0,25% de tripsina. </li><li> El plato se incuba a 37 ˚ C durante unos 2 minutos hasta que las células han comenzado a separar. </li><li> 5,5 ml de medio de A es para neutralizar la tripsina y las células se contó con un hemocitómetro. </li><li> Las células se diluyen a 320.000 células por ml y se distribuye a 0,1 ml por pocillo en una polilisina recubiertos de 96 y placa de cultivo. </li><li> Coloque el plato en un cultivo de tejidos incubadora a 37 ˚ C con una atmósfera con CO2 un 8,8% y crecer durante 24 horas. </li></ol> Transfecciones <ol><li> En la preparación para la transfección, se debe considerar el número de repeticiones se van a realizar por las condiciones experimentales y qué cantidades de plásmido se transfectadas ser. En forma rutinaria realizar todas las condiciones, por triplicado, y transfectar un total de 50 a 100 ng de ADN de plásmido por pozo. Mezcla plásmido debe incluir al menos un reportero construir expresar luciferasa de luciérnaga y un plásmido de control luciferasa Renilla expresión de un promotor constitutivo. </li><li> Soluciones de plásmido se pipeta en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y se complementa con 10 l por muestra de suero libre de antibióticos y de libre DMEM. Por ejemplo, si 20 pozos son cada uno para ser transfectadas con el ADN de 50 mg, añadir 200 l DMEM al ADN mg 1. </li><li> A la solución de DMEM / ADN añadir 3 l &#39;Transit 293 reactivos (Mirus) por ADN mg. Mezclar pipeteando arriba y abajo y dejar que las muestras a temperatura ambiente durante al menos 10 min. </li><li> Durante este período, retire el soporte de la placa de 96 pocillos cultura y reemplazar con 90 l de medio fresco A. </li><li> A cada pocillo añadir 10 l de la DMEM / ADN / Tránsito 293 mezcla. </li><li> Coloque el plato en un cultivo de tejidos incubadora a 37 ˚ C con una atmósfera con CO2 un 8,8% y crecer durante 24 horas. </li></ol> Fagocitosis <ol><li> Preparar las suspensiones que contienen medio B (una mezcla 1:1 de DMEM y Ham F12 más antibióticos y un 10% FBS) más de 0,75 m perlas de látex en el cero a 1 mg por ml. </li><li> Retire el papel de la placa de 96 pocillos cultura y reemplazar con 0,1 ml de suspensiones de cuentas en el medio B. </li><li> Girar la placa durante 2 min a 1000 x g. </li><li> Las células se cultivaron a 37 ˚ C durante 6 a 16 hrs. Dependiendo de las condiciones y el promotor utilizado para dirigir la expresión de luciferasa, el aumento de gen reportero puede ser detectada después de 1 a 3 horas. </li><li> En los mismos casos puede ser necesario para la incubación de las células con perlas de 30 a 60 minutos, y luego hacer dos lavados con PBS para eliminar las perlas no incorporadas, y añadir medio fresco antes de incubar las células durante períodos de tiempo adicional. </li></ol> Doble GloTM ensayo Luciferase <ol><li> Nota: el protocolo para el uso de este kit es diferente en algunos aspectos de la recomendada por el fabricante. Se ha modificado para reducir la cantidad de reactivos necesarios por muestra. </li><li> Prepare una solución de 1 M de TDT, se dividen en varias pequeñas alícuotas y guardar a -20 ˚ C. </li><li> Prepare una solución amortiguadora de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,8), el 10% (v / v) de glicerol, y el 0,5% (v / v) de Triton X-100. Antes de su uso, una parte alícuota de la cantidad necesaria para el experimento y añadir 1 l por ml de 1 M de TDT más cóctel inhibidor de la proteasa a una concentración final de 0,5 a 1x. No vuelva a utilizar la solución remanente de la TDT. </li><li> Cuando se utiliza el kit de doble GloTM por primera vez, preparar el reactivo (luciérnaga) luciferasa mediante la transferencia de todo el contenido de un frasco de tampón luciferasa Dual-GloTM (suministrado con el kit) a una botella de sustrato luciferasa Dual-GloTM (siempre con el kit). Divide el reactivo utilizado luciferasa en 10 ml de alícuotas y guardar a -20 ˚ C. </li><li> Retire la placa de 96 pozos de la incubadora de cultivo de tejido y colocarlo sobre hielo. Retire el papel por aspiración, añadir 40 l por pocillo de tampón de lisis, y luego dejar la placa en hielo durante 30 min. </li><li> En un color blanco opaco, placa de 96 pocillos (OptiplateTM-96, Perkin Elmer número de catálogo 6005290) alícuota de 15 l por pocillo de reactivo de luciferasa, a continuación, añadir 15 l de lisado celular. </li><li> Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego leer la luminiscencia en un lector de microplacas. </li><li> Inmediatamente antes de su uso, prepare una cantidad apropiada de solución de sustrato de luciferasa Renilla mediante la adición de una parte de doble GloTM Stop &amp; Glo ®; Reactivo (suministrado con el kit) a 100 partes de doble GloTM Stop &amp; Glo ® Buffer (suministrado con el kit). </li><li> A cada pocillo añadir 15 l por pocillo de la solución de sustrato de luciferasa Renilla, incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego medir la luminiscencia de nuevo. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

el estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Para el estudio de la coordinación de las diferentes vías de síntesis de lípidos en la biogénesis de la membrana es muy útil para trabajar con un sistema experimental en la biogénesis de la membrana se produce rápidamente y de forma inducible. Hemos encontrado que la fagocitosis de perlas de látex es práctica para estos fines, como las células de rápido sintetizar lípidos de membrana para llenar piscinas membrana perdido como el material de envoltura en inmersión de las partículas. Aquí se describen los procedimientos para el estudio de los cambios en la fagocitosis inducida por la expresión de genes con un enfoque de luciferasa basado en genes utilizando el sistema de doble Glo Luciferase Assay de Promega.

Aquí se describen los procedimientos para el estudio de los cambios en la fagocitosis inducida por la expresión de genes con un enfoque de luciferasa basado en genes utilizando el sistema de doble GloTM ensayo luciferasa de Promega.

El estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes

Para estudiar la coordinación de las diferentes vías de síntesis de lípidos durante la biogénesis de membranas, resulta útil trabajar con un sistema experimental donde la membrana...

Hola, soy IL OV y estudio la coordinación de diferentes vías de síntesis de lípidos en relación con la memoria y la biogénesis. Es útil contar con un sistema experimental en el que la biogénesis de membranas ocurra rápidamente y sea inducible. Descubrimos que la fagocitosis de partículas de látex es particularmente útil para estos estudios, porque las células sintetizan muy rápidamente membranas nuevas para reponer aquellas que se perdieron como material envolvente al principio del proceso de ingestión.En este video, mi colega Ong Zang demostrará los procedimientos utilizados para estudiar los cambios inducidos por la fagocitosis en la expresión génica mediante un ensayo de reportero basado en la luciferasa I, donde, hola, soy X del grupo de exon North del Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de Harvard. Hoy les mostraré cómo utilizar un ensayo de gen reportero para analizar la regulación de genes implicados en la biogénesis de membranas tras la fagocitosis. Comencemos.Para este procedimiento, utilizamos cultivos de células 293 de riñón embrionario humano. Estas células se cultivan en placas de 10 centímetros de diámetro en medio A, que consiste en el medio de Eagle modificado por Dulbecco o DMM suplementado con 10% de suero bovino fetal o FBS y un cóctel de antibióticos. Mediante una técnica de estandarización, las células se separan del fondo de la placa, se cuentan y luego se siembran en placas de 96 pocillos recubiertas con polilisina, donde se cultivan durante 24 horas antes de iniciar las transfecciones.Para nuestra transfección, habitualmente realizamos todas las condiciones por triplicado y la transfección, un total de 50 a 100 nanogramos de ADN plasmídico por pocillo. Las mezclas deben incluir al menos el constructo reportero que expresa luciferasa de luciérnaga y el plásmido de control que expresa luciferasa renal bajo un promotor constitutivo. Para comenzar, prepare una mezcla de DMEM sin suero ni antibióticos con el reactivo de transfección trans 2 N 3; utilice 10 microlitros de DMEM por cada pocillo a transfectar y 3 microlitros del reactivo trans 2 9 3 por microgramo de ADN plasmídico.Por ejemplo, si 20 pocillos deben transfectarse con 50 nanogramos de ADN con tres microlitros del reactivo trans 2 9 3 en 200 microlitros de DM EM. La solución se mezcla pipeteando repetidamente hacia arriba y hacia abajo y luego se deja reposar sin perturbar a temperatura ambiente durante al menos cinco minutos. A continuación, el ADN se pipetea en tubos separados de microcentrífuga. Las concentraciones de nuestras soluciones stock de plásmido suelen estar entre 10 y 100 nanogramos por microlitro.Una vez que la mezcla de tránsito de DM M haya incubado durante cinco minutos, se transfiere al tubo de ADN y la solución se mezcla nuevamente mediante pipeteo. Luego, se dejan las muestras en reposo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Durante la incubación de 20 minutos, retire el medio del plato de cultivo de 96 pocillos y reemplácelo con 19 microlitros de medio fresco A una vez que la incubación haya finalizado; agregue 10 microlitros de la mezcla D-M-M-D-N-A traducida a tres a cada pocillo.La mezcla debe pipetearse directamente en el líquido existente. No permita que la punta de la pipeta toque la pared del tubo. También es importante incluir tres pocillos de células que permanecerán sin tratar e inspeccionados.La actividad promedio de luciferasa en estos pozos se restará posteriormente como fondo. Coloque la placa de 96 pozos en el incubador a 37 grados C y cultive las células durante 24 horas. Una vez completada la incubación de 24 horas, procedemos con la inducción de la biosíntesis de membrana, biosis de perlas lax. Para comenzar, prepare una suspensión que contenga medio de cultivo celular y perla lax.Para hacer esto, prepare el medio B, que es una mezcla uno a uno de DM EM y hemps, medio F term más antibióticos y 10 % de FBS. Luego agregue las microesferas de 0,75 micrones a concentraciones de hasta un miligramo por mililitro. Por supuesto, cada experimento debe incluir controles en los que no se agreguen microesferas.A continuación, retire el medio de la placa de cultivo de 96 pocillos y sustituya cada pocillo con 100 microlitros de la suspensión de microesferas. Una vez añadida la suspensión, centrifugue la placa durante dos minutos a 1000 G. Esto ayuda a concentrar las microesferas en el fondo del pocillo y facilita la fagocitosis. A continuación, incube las células a 37 grados C durante seis a 16 horas.Dependiendo de las condiciones y del promotor utilizado para inducir la luciferasa, el aumento de la expresión génica del promotor puede detectarse tras una a tres horas. Para ciertos experimentos, podría ser necesario desacoplar fal de la síntesis de lípidos, por ejemplo, para estudiar los efectos de ciertas drogas sobre la síntesis de lípidos sin afectar la partícula en gobierno. En tales casos, incubar las células con el beat durante 30 a 16 minutos para permitir que las células citoten las perlas.Después de esta incubación, las células se lavan dos veces con PBS para eliminar las perlas no incorporadas. Luego se añade medio fresco y las células se incuban durante seis a 16 horas para la expresión del gen reportero. Ahora estamos listos para proceder con los ensayos ferrosos.Para comenzar los ensayos de luciferasa, prepare un tampón xis que contenga 20 millones de molar de árboles, HCl pH 7,8, glicerol al 10% volumen/volumen y Triton X-100 al 0,5% volumen/volumen. Antes del uso, prepare la cantidad adecuada necesaria para el experimento. Luego añada un microlitro por mililitro de DTT uno molar. No reutilice la solución sobrante de DTT.Luego, agregue un cóctel de inhibidores de proteasas a una concentración final de 0,5 a una vez, cuando utilice por primera vez el kit dual glow, prepare el reactivo de luciferasa de luciérnaga transfiriendo todo el contenido de un frasco de tampón dual glow luciferasa a un frasco de sustrato de luciferasa dual glow. Divida el reactivo de luciferasa no utilizado en alícuotas de 10 mililitros y almacénelo a menos 20 grados C. Una vez que el reactivo de luciferasa esté listo, retire la placa de 96 pocillos del incubador de cultivo de tejidos y colóquela sobre hielo. A continuación, elimine el medio por aspiración, luego agregue 40 microlitros por pocillo de tampón de lisis y deje la placa sobre hielo durante 30 minutos.A continuación, añada 15 microlitros del reactivo Lucifer por pocillo. En una placa opaca blanca de 96 pocillos, utilice la placa Perkin S optive plate 96. Luego, añada 15 microlitros de lisado celular y incube la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos.Después de 10 minutos, lea la luminiscencia en un lector de microplacas. A continuación, realice el ensayo de luciferasa convencional para obtener datos del plásmido de control. Para ello, prepare inmediatamente antes, una cantidad adecuada de solución de sustrato de luciferasa añadiendo una parte de reactivo dual glow, stop and glow a 100 partes.Doble brillo, detener y tampón de brillo. A continuación, añada 15 microlitros de solución de sustrato a cada pozo. Incube la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego mida nuevamente la luminiscencia.Tenga en cuenta que modificamos el protocolo recomendado por el fabricante para estos ensayos duales con luciferasa. Con el fin de reducir la cantidad de reactivos necesarios por muestra, ahora la placa puede analizarse nuevamente utilizando un lector de placas. Una vez que los datos se han recopilado con el lector de microplacas, pueden transferirse a un programa de hojas de cálculo como Microsoft Excel para su análisis posterior.Primero, calcule el promedio de los tres pocillos no resecados y reste ese valor de cada uno de los puntos de datos. A continuación, divida para cada pocillo transfectado el valor de la luciferasa de luciérnaga por el de la luciferasa de *Renilla* y luego calcule, para cada conjunto de muestras en triplicado, el promedio, la desviación y el coeficiente de variación.En nuestro ejemplo, utilizamos las diferentes concentraciones de perlas que se han representado en el eje x frente a la relación de actividad luciférea frente a luciférea de vainilla. Como puede observar, existe un aumento dependiente de la dosis en esta relación. Acabamos de mostrarle cómo usar un ensayo de gen reportero basado en luciferasa para medir la expresión del promotor del receptor de LDL en respuesta a la fagocitosis de esferas de látex.Al realizar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que las células estén solo al 80-90 % de confluencia en el momento de la transfección. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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