Name: Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados en ovocitos de Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende la técnica de patch clamp en ovocitos de Xenopus laevis para estudiar canales iónicos. Este método permite formar sellos de gigaohm y configuraciones outside-out para investigar propiedades electrofisiológicas con precisión.

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Receta de la reducción de solución es el laboratorio de RW Aldrich. Agradecemos a los siguientes organismos de financiación y fundaciones de apoyo: National Institutes of Health, National Science Foundation, la American Heart Association, Asociación de Distrofia Muscular, de la B. Donald y Delia E. Baxter Foundation, el Fondo Klingenstein y la Fundación McKnight para la Neurociencia.

Parte 1: Extracción de la membrana vitelina <ol><li> Prepare dos juegos de pinzas. Preferimos No. 5 pinzas, donde ha sido un conjunto ligeramente afilado con una lima. También preparan una pipeta de transferencia de cristal por el recorte y pulido fuego-a 7 &quot;pipeta Pasteur. </li><li> Recomendado: Para evitar que los oocitos de deslizamiento, cortar un círculo de rejilla (1 plazas mm) y pegamento en la parte inferior de una placa de Petri de 60 mm. Este plato se puede reutilizar indefinidamente si se mantienen limpias entre los usos. </li><li> Llene la caja de Petri hasta la mitad con una solución hiperosmótico (ver receta) y de lugar en un microscopio de disección. </li><li> Quitar 1-3 ovocitos de Xenopus de su solución de incubación con una pipeta Pasteur pulida y colocar en el plato. </li><li> Espere 15 segundos - 2 minutos para que las células comienzan a contraerse. Ya veces hacen que las células más fáciles de pelar, menor tiempo de llevar a las células sanas del parche. </li><li> A medida que la célula se contrae, la membrana vitelina que comienzan a ser apenas visible como una capa transparente sobre la celda. Seleccione una célula sana (sin espirales o defectos) para pelar. </li><li> Con un par de pinzas, pellizque suavemente la membrana vitelina, sin dañar la membrana plasmática. Con el otro, captar cerca del mismo lugar y suavemente romper la membrana clara separación y libre de la célula. </li><li> Con la pipeta Pasteur, cuidadosamente el movimiento de la célula a la cámara de grabación. Tenga en cuenta que la celda será frágil después de la eliminación vitelino. </li></ol> Parte 2: generación Gigaseal <ol><li> Llenar una pipeta de grabación con solución salina. Use el volumen mínimo de solución que hace buen contacto eléctrico con el cable del electrodo con el fin de minimizar la capacitancia pipeta. </li><li> Flick varias veces la pipeta para permitir que las burbujas para flotar y deslizarse sobre el alambre del electrodo. Aplique presión a la pipeta llena. Esto se puede hacer por vía oral o con una bomba de acuario de una tienda de mascotas. Esta presión es fundamental para mantener la pipeta limpia a su paso por la interfase líquido y se mueve a la celda. </li><li> Buscar el ovocito en la cámara y enfocar bien en el borde de la célula. </li><li> Con la pipeta de la bañera, el centro de la punta (fuera de foco) por encima de la celda. Esto minimiza el tiempo gastado en el baño antes de la generación del sello. </li><li> Caída de la pipeta hacia abajo sobre el tapete junto a la celda. Lo pongo en las proximidades (~ 50 micrones). Usted debe ver una pequeña distorsión de la solución empujado fuera de la pipeta por la presión de la espalda. </li><li> Usando el software de patch clamp, comprobar la resistencia de la pipeta (nuestra meta es de aproximadamente 3.4 MW) y el cero actual con la tensión de offset. </li><li> Con una presión positiva en la pipeta, mover la punta lentamente hacia la célula, mientras que el control de la resistencia visualmente o mediante un monitor de audio que genera un tono cuya frecuencia es proporcional a la resistencia. Como la punta empieza a tocar el celular, la resistencia aumentará. </li><li> De pronto, suavemente pero con cambiar de positivo a la presión negativa de aproximadamente el mismo valor absoluto. La resistencia debe aumentar para sellar la formación. </li><li> La mayoría de las veces, la formación de sello se produce en cuestión de segundos, en ocasiones 30-60 segundos son necesarios. </li><li> Una vez que la resistencia se encuentra en 1GΩ, la presión puede ser liberado a la posición neutral. Ahora tiene un parche en las células. De un parche de adentro hacia fuera, se alejan de la célula con rapidez. Por fuera, fuera, ver a continuación. </li></ol> Parte 5: Fuera de salida topología (opcional) <ol><li> Inmediatamente después de lograr una ruptura gigaseal, la membrana. Esto se puede hacer con la succión fuerte, pero nosotros preferimos un 1 V pulso de 1 ms. La resistencia debe caer a poco más de la resistencia inicial de la pipeta. </li><li> Mueva la pipeta fuera de la celda lenta y suavemente. Usted debe ver una sección de la atracción de células con la pipeta. De repente, y en unos pocos segundos, la célula se ajustará hacia atrás y la resistencia debe de inmediato y al mismo tiempo volver a GΩs. </li><li> Ahora tiene un parche en la configuración exterior de salida. El ectodomains de los canales de iones se incluye expuestos a la bañera. </li></ol> Parte 6: Resultados esperados Generalmente, cuanto mayor resistencia a las focas son preferibles y vivieron más tiempo. 10 GΩ es una buena guía de alta calidad de los sellos. En nuestra experiencia, las posibilidades de conseguir los sellos de esta calidad varía con muchos factores, sobre todo de células y una pipeta de calidad. Las tasas de adquisición de parches pueden ser más del 95% con las células sanas, pipetas limpias, y un investigador experimentado. Estas manchas pueden durar muchos minutos y son adecuados para cualquier estudio electrofisiológico de los canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus, incluyendo grabaciones de un solo canal.

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Sackmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSackmann%2C+B+%22Single-channel+Recording%22">Single-channel Recording</a>. , Plenum Press. New York. (1983).</li>
</ol>

Hay muchos parámetros de registro electrofisiológico no se discute aquí. Configuración de plataforma, sistema de gestión de ruido, la expresión de los canales y protocolos de registro son también fundamentales para un buen resultado experimental. En nuestra experiencia, estos son los parámetros más importantes para la formación de sellos fiables: los ovocitos de alta calidad, la eliminación de la membrana vitelina rápidamente (también conocido como &quot;peeling&quot;), usar pipetas de nueva tira protegidos del polvo, pipetas suave ...

<table><tbody><tr><td>Amplificador de registro por parche &amp;y Software</td><td>Instrumento</td><td>HEKA Instruments</td><td>EPC-10</td><td>O cualquier otro dispositivo similar (por ejemplo, HEKA EPC-9 o Axopatch 200B)</td></tr><tr><td>Pinzas número 5 (dos pares)</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de encogimiento de ovocitos</td><td>Reactivo</td><td></td><td></td><td>Ingrediente En mMN-metil-D-glucamina 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Ácido aspártico 220KCl 2Ajustar el pH a 7,4 con N-metil-D-glucamina</td></tr><tr><td>malla tejida</td><td>800 µm</td><td>Spectrum Labs</td><td>146481</td><td></td></tr></tbody></table>

parche de grabación clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de xenopus

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Desde su desarrollo por Sakmann Neher y 1, 2, el patch clamp se ha establecido como una técnica muy útil para la medición electrofisiológica de los canales de iones únicos o múltiples en las células. Esta técnica se puede aplicar a los canales de iones, tanto en su ambiente nativo y se expresa en células heterólogas, tales como oocitos recolectados de la rana de uñas africana, Xenopus laevis. Aquí se describe la técnica bien establecida de la grabación de patch clamp de los ovocitos de Xenopus. Esta técnica se utiliza para medir las propiedades de los canales iónicos, expresados ​​en las poblaciones (macropatch) o de forma individual (un solo canal de grabación). Nos centramos en las técnicas para maximizar la calidad de la preparación de los ovocitos y la generación de sello. Con todos los factores optimizado, esta técnica da una probabilidad de éxito en la generación de sello 90 por ciento. El proceso puede ser optimizado de manera diferente por cada investigador sobre la base de los factores que él o ella encuentra más importante, y se presenta el enfoque que han llevado al éxito más grande en nuestras manos.

Esta pretende ser una introducción a la revisión de la grabación de la abrazadera ovocitos de Xenopus laevis. Cubre la eliminación vitelina membrana, la formación de un sello gigaohm (gigaseal), y la conversión opcional de la revisión a la topología de fuera-out.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Desde su desarrollo por Sakmann y Neher 1, 2, el patch clamp se ha consolidado como una técnica extremadamente útil para la electrofisiología...

Este procedimiento comienza con la eliminación de la membrana vilina de los Opus citos para formar con éxito los sellos resistentes al gigaohmio necesarios para las grabaciones mediante el método de parche. Una vez que se ha obtenido la configuración de parche en célula intacta, se puede aplicar succión a la pipeta para obtener acceso eléctrico al citoplasma de la célula, lo que se conoce como configuración de parche en toda la célula. A continuación, la punta de la pipeta puede retirarse de la membrana plasmática hasta que se desprenda, con el fin de obtener un pequeño parche de membrana en el que los dominios ectos de los canales queden expuestos a la solución del baño; esto se conoce como configuración de parche fuera hacia afuera. Hola, soy Austin Brown del laboratorio de la Dra. Miriam Goodman del Departamento de Fisiología Molecular y Celular de la Universidad de Stanford.Y yo soy Brandon Johnson, también del laboratorio Goodman. En un video anterior, demostramos cómo fabricar pipetas para registro de parches y electrodos afilados para electrofisiología. Hoy presentaremos una introducción al registro mediante parche de canales iónicos expresados en zpa.Desde su desarrollo por

patch-clamp-recording-of-ion-channels-expressed-in-xenopus-oocytes

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan...

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

Describimos un método para cuantificar la actividad de las ATPasas de tipo P que contratransportan K+ mediante la expresión heteróloga de las enzimas en los ovocitos de Xenopus y midiendo la absorción de Rb+ o Li+ en células individuales mediante espectrofotometría de absorción atómica. El método es una alternativa sensible y segura a los experimentos de flujo de radioisótopos, ya que facilita estudios cinéticos complejos.

Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los ovocitos mediante espectrofotometría de absorción atómica: una alternativa a ensayos de radioisótopos

Hemos desarrollado una preparación espinal cerebral espinal intacta para registrar y monitorear la actividad eléctrica a través de la grabación de patch clamp de las neuronas y otras células de Mauthner reticulospinal en embriones de pez cebra. Por lo tanto, somos capaces de registrar las corrientes sinápticas excitatorias e inhibitorias, la actividad del canal dependiente de voltaje y los potenciales de acción de las neuronas clave en un embrión en desarrollo.

Patch Clamp Las grabaciones de las células embrionarias de pez cebra Mauthner

El enfoque de BPA vaselina de corte abierto se utiliza para obtener bajos grabaciones de ruido de corrientes iónicas y conmutación de canales iónicos dependientes de voltaje expresados ​​en oocitos de Xenopus con alta resolución de la cinética de canal rápido. Con modificaciones menores, fluorometría de fijación de voltaje puede estar acoplado con el protocolo de ovocitos de corte abierto.

La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocitos-Cut abierta vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Con Fluorometría

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

En este artículo discutimos tres preparaciones de cerebro utilizadas para la grabación de abrazadera de parche de células enteras a estudiar el circuito retinotectal de los renacuajos de Xenopus laevis . Cada preparación, con sus propias ventajas específicas, contribuye a la maleabilidad experimental de los renacuajos de Xenopus como modelo para el estudio de la función neuronal del circuito.

Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

Aquí presentamos un protocolo para expresar las proteínas de unión de brecha en ovocitos de Xenopus y registrar la corriente de unión entre dos ovocitos appuestos utilizando un amplificador comercial diseñado para grabaciones de abrazadera de voltaje de ovocitos duales en un modo de medición de corriente lateral alta.

Registro de la corriente de unión gap de los ovocitos de Xenopus

Métodos para grabaciones de parche Capacidad de la pinza del cáliz

Aprende la técnica de patch clamp en ovocitos de Xenopus laevis para estudiar canales iónicos. Este método permite formar sellos de gigaohm y configuraciones outside-out para investigar propiedades electrofisiológicas con precisión.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

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