Pulido a presión para la Mejora de pipetas de patch-clamp grabación
22 de octubre de 2008
Esta es una guía para modificar la forma de pipetas de vidrio. En concreto, mediante el uso de calor y presión de aire el cono se ensancha sin aumentar la apertura de la punta, lo que lleva a la resistencia a la pipeta inferior. Esto es fundamental para conseguir grabaciones de bajo nivel de ruido de células pequeñas, pero es útil en muchas aplicaciones.
Este procedimiento comienza colocando la punta de la pipeta cerca del filamento de pulido con una ampliación de 100 veces. A continuación, encienda la presión de aire y el calor. El filamento.
La punta de la pipeta se expandirá para formar una punta de forma roma. Apague el calor para obtener una abertura más pequeña de la punta. Apague nuevamente la presión y el calor.
Hola, soy Brandon Johnson del laboratorio de la Dra. Miriam Goodman en el Departamento de Fisiología Molecular y Celular de la Universidad de Stanford. Hoy les mostraremos un procedimiento para pulir por presión las pipetas para parche. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar canales iónicos y parches de membrana en neuronas de C. elegans.
Así que comencemos. Prepare un conjunto de seis a diez pipetas para registro. Consulte a un experto local o a nuestro experimento visualizado sobre la elaboración de pipetas para registro y electrodos afilados con un micropipeteador programable polar para obtener ayuda.
Para comenzar el procedimiento, ajuste la presión del aire comprimido a aproximadamente 40 PS.I, luego conecte la línea de aire comprimido a una válvula de control de cuatro vías. Conecte un tramo de tubo plástico a la válvula de cuatro vías y sujete un porta-pipetas de alta presión al extremo libre del tubo plástico. Utilice un equipo microfusor para realizar el pulido.
Utilizamos el kit Ccpm dos de LA Scientific. Este dispositivo tiene un soporte para pipetas de alta presión, un filamento de platino para calentamiento controlado mediante un pedal y un microscopio equipado con objetivos de baja y alta magnificación, 10 veces y 100 veces, respectivamente. Son ideales los objetivos de larga distancia de trabajo en aire, ya que es fundamental poder observar la abertura de la pipeta durante el protocolo.
A continuación, verifique que la válvula de presión esté en la posición apagada. Luego, coloque una pipeta en el soporte para pipetas y apriete el accesorio hasta que quede firme al tacto, por seguridad en el laboratorio. Asegúrese de que la pipeta esté bien sujeta en el soporte para pipetas.
De lo contrario, la presión del aire hará que la pipeta se salga del porta-pipeta. Como paso opcional, puede recubrir la pipeta con un aislante hidrofóbico, como cera, para reducir la capacitancia y mejorar las características de ruido. Ahora coloque la pipeta en el porta-pipeta en la posición del microforno; coloque el porta-pipeta sobre la platina del microscopio de manera que tanto la punta como el filamento de pulido sean visibles con un aumento bajo de 10 veces en el microforno.
Coloque la punta aproximadamente a 50 micrones del filamento, luego cambie al objetivo de alta potencia de 100, tanto la punta de la pipeta como el filamento de pulido deben estar enfocados y dentro del campo de visión. Si no es así, ajuste la altura del filamento. Dado que la posición de la pipeta no se puede ajustar, la punta de la pipeta y el filamento deben estar en lados opuestos del campo de visión.
Evite colocar la punta de la pipeta demasiado cerca del filamento, ya que este se expandirá al calentarse y podría chocar con su pipeta. Una vez que la punta y el filamento estén correctamente posicionados, gire la válvula para dirigir aire presurizado hacia la pipeta y caliente la punta de la pipeta hasta que la zona cónica detrás de la punta comience a hincharse hacia afuera. Detenga el calentamiento antes de que la punta se hinche excesivamente.
Se requiere experimentación para determinar la distancia, el calor y el tiempo adecuados para la forma deseada. Como paso opcional, también puede pulir la punta en ausencia de presión con el fin de reducir el diámetro de la abertura de la punta. Además, tenga en cuenta que estos pasos de pulido se pueden repetir para ajustar con precisión.
Ajuste tanto la forma como las dimensiones de la punta de la pipeta. Cuando finalice el pulido, apague la presión y dirija la punta de la pipeta en una dirección segura.
Retire la pipeta y colóquela en una caja de almacenamiento limpia donde esté protegida del polvo. Por seguridad en el laboratorio, asegúrese de desconectar la presión antes de retirar la pipeta; de lo contrario, podría salir expulsada del soporte de pipetas.
Tras la extracción, le acabamos de mostrar cómo pulir pipetas por presión para mejorar las grabaciones de parche. Al realizar este procedimiento, es importante recordar recubrir la bobina de pulido con vidrio de alta temperatura de fusión para minimizar la deposición de metal vaporizado sobre las pipetas, y tener precaución mientras las pipetas están expuestas al aire presurizado.
Asegúrese de que la pipeta esté firmemente sujeta en el soporte y de apagar el aire antes de retirar la pipeta del soporte. Eso es todo. Gracias por ver.
Que tenga una feliz pulida por presión y mucha suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Esta guía describe la modificación de las formas de micropipetas de vidrio mediante calor y presión de aire. El proceso permite ensanchar la zona cónica sin aumentar la abertura de la punta, lo cual es esencial para lograr grabaciones con bajo nivel de ruido en aplicaciones con células pequeñas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Fabricación de micropipetas
Antecedentes
- Las micropipetas de vidrio son herramientas fundamentales en los registros electrofisiológicos.
- Es necesario un menor valor de resistencia de la pipeta para obtener registros de alta calidad.
- La modificación de la forma puede mejorar el rendimiento en diversas aplicaciones.
- Esta técnica es particularmente beneficiosa para los registros en células pequeñas.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método para moldear micropipetas de vidrio.
- Reducir la resistencia de la pipeta sin ampliar la abertura de la punta.
- Mejorar la calidad de las grabaciones obtenidas de células pequeñas.
Métodos Utilizados
- Colocar la punta de la pipeta cerca de un filamento de pulido con ampliación alta.
- Aplicar presión de aire y calor para expandir la punta de la pipeta.
- Apagar el calor para obtener una abertura más pequeña en la punta.
- Ajustes finales apagando la presión y el calor.
Resultados principales
- La punta de la pipeta puede moldearse eficazmente en una forma roma.
- Se logra una resistencia menor sin aumentar el tamaño de la punta.
- Este método mejora la calidad de la grabación en células pequeñas.
- Demuestra un enfoque práctico para la modificación de micropipetas.
Conclusiones
- La conformación de micropipetas de vidrio es una técnica valiosa en la investigación en neurociencia.
- Un diseño mejorado de pipetas conduce a una mayor calidad de los datos.
- Este método puede aplicarse en diversos estudios electrofisiológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El pulido por presión de pipetas reduce la resistencia eléctrica en grabaciones de parche adherido sin alterar el diámetro de la punta, lo que permite mediciones de canales iónicos con mayor fidelidad en poblaciones neuronales pequeñas. Esta mejora técnica apoya la validación de dianas en el descubrimiento de fármacos en neurociencia al mejorar las relaciones señal-ruido en ensayos electrofisiológicos. Una calidad de grabación mejorada aumenta la confianza predictiva en estudios mecanicistas de etapa temprana sobre la excitabilidad neuronal y la función sináptica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de la función de los canales iónicos en neuronas de pequeño diámetro, fundamentales para el dolor neuropático y los objetivos de epilepsia.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad en los registros de canales individuales al minimizar el ruido inducido por la pipeta.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Produce geometrías estandarizadas de pipetas para paneles de cribado electrofisiológico reproducibles.
- Valor operativo: Compatible con micropipetas de vidrio blando y duro, lo que permite un diseño de ensayo flexible en diferentes clases de dianas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Apoya las aplicaciones del registro de parche perforado al generar puntas romas que aumentan la formación de blebs de membrana para perforantes antibióticos.
- Valor operativo: Extiende la duración del registro en cultivos neuronales primarios, mejorando el rendimiento para estudios de optimización de fármacos líderes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que el fenotipado electrofisiológico orienta la selección de dianas y el perfilado de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Permite la validación funcional de dianas de canales iónicos en modelos neuronales relevantes para la enfermedad.
- Selección: Proporciona pipetas de baja resistencia para la selección de compuestos con alta fidelidad en plataformas de registro de parche.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de corriente y conductancia con mayor estabilidad de la señal.
- Investigación Traducional: Facilita el registro longitudinal en cortes agudos y neuronas en cultivo para la modelización farmacocinética-farmacodinámica.
- Reutilización Empresarial: Requiere únicamente una actualización con microfusora, lo que constituye una mejora escalable y de bajo costo para la infraestructura existente de electrofisiología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del objetivo mediante fenotipos electrofisiológicos más limpios.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad del ensayo entre diferentes sitios y operadores al estandarizar la geometría de las pipetas.
- Valor estratégico: Reduce los falsos negativos en el cribado de canales iónicos al minimizar el ruido técnico.
- Impacto en la cartera: Apoya las decisiones de avance o interrupción en programas preclínicos dirigidos a la excitabilidad neuronal.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de micropipetas y en electrofisiología.
- Necesita un microfórjido con válvula de alta presión, filamento calefactor y óptica de aumento.
- Exige la estandarización de los parámetros de presión, calor y tiempo entre diferentes usuarios.
- Debe tener en cuenta las diferencias entre tipos de vidrio (vidrio de sodio-calcio frente a borosilicato) en la respuesta al pulido.
- Está limitado por la necesidad de posicionamiento manual de la punta y la habilidad del operador para evitar la sobreexpansión.
