Name: measuring bacterial resistance with e-tests
Uploaded: 2023-04-30T07:10:10.000Z
Duration: 13 min 39 s
Channel: JoVE

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High School

Life Sciences

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From Molecules To Organisms: Structures And Processes

HS-LS1-8

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Antibiotic Susceptibility Testing: Epsilometer Tests to Determine MIC Values of Two Antibiotics and Evaluate Antibiotic Synergy

1. Tests d'epsilomètre (E-tests)
<ol><li>
arrangement
	<ol>
<li>Portez des gants et une blouse de laboratoire</li>
		<li>Préparer l'espace de travail en le stérilisant à l'aide de 70 % d'éthanol</li>
		<li>Recueillir les plaques d'agar Mueller-Hinton (plaques MHA)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation d'une norme de turbidité McFarland no 0.5
	<ol>
<li>Préparer une solution de 1% de chlorure de baryum (BaCl2): Ajouter 1 gramme de chlorure de baryum anhydre (BaCl2) dans 100 ml d'eau distillée. Vortex bien.</li>
		<li>Préparer une solution de 1% d'acide sulfurique (H2SO4): Ajouter 1 ml de H2SO4 concentré dans 99 ml d'eau distillée. Vortex bien.</li>
		<li>Préparer une norme de turbidité McFarland no 0.5 : 50 l Solution BaCl2 en 5 ml de 1% H2SO4 solution. Vortex la solution bien pour obtenir une suspension turbide.</li>
		<li>Gardez la norme de turbidité McFarland no 0.5 dans un tube recouvert de papier d'aluminium. Conserver à 25oC pendant un maximum de 6 mois. Vortex bien à une solution homogène avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des plaques MHA
	<ol>
<li>Scrape Streptococcus groupe G bactéries de la plaque d'agar de sang à l'aide d'une boucle stérile. Mélanger dans 1mL de salin, et le vortex à une suspension de la bactérie.</li>
		<li>Comparez la suspension à une norme McFarland no 0.5 pour obtenir la même turbidité afin d'avoir la même taille d'inoculum pendant les expériences. Ajuster la concentration à l'aide d'un salin ou d'une bactérie supplémentaire.</li>
		<li>Inoculer les plaques MHA à l'aide d'un applicateur à pointe de coton stérile. Écouvillons la plaque délicatement pour couvrir la surface. Procédez avec l'une des trois méthodes décrites ci-dessous (1.4-1.6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Test unique de résistance aux antibiotiques. Streptococcus groupe G, résistance à la pénicilline G ou gentamicine <ol>
<li>Placez une bande d'essai E (pénicilline G ou gentamicine) au centre de la plaque MHA (figure 1 A,B).</li>
		<li>Incuber pendant 18-20 heures, 37oC.</li>
		<li>Lisez les résultats. Le MIC est mesuré comme la zone d'inhibition qui croise la bande d'essai d'antibiotiques notée (Figure 1 C,D).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig1.jpg"> Figure 1 : Test électronique unique. Placement d'une bande E-test de A) pénicilline G et B) gentamicine sur une plaque d'agar Mueller Hinton recouverte de colonies bactériennes d'un groupe G streptocoques avant (A et B) et après (C et D) du jour au lendemain incubation à 37oC 5% CO2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<ol start="5"><li>
Test de synergie inter-approche. Streptococcus groupe G, résistance à la pénicilline G et gentamicine.<ol>
<li>Placez deux bandes d'essai Électronique avec différents antibiotiques (p. ex. pénicilline G et gentamicine) sur la plaque MHA inoculée dans une formation croisée.<ol>
<li>Pour obtenir les résultats les plus précis, visez à placer la croix à un angle d'environ 90 degrés à l'intersection des échelles à leurs valeurs MIC, précédemment déterminées à l'essai unique de résistance aux antibiotiques (figure 2 A).</li>
			<li>Notez qu'une fois que les bandes sont placées sur la plaque d'agar, elles ne doivent pas être déplacées, puisque certains antibiotiques peuvent déjà avoir été absorbés par la plaque. Par conséquent, il est plus approprié de maintenir les bandes à un angle légèrement erroné (p. ex. 85 degrés) et jusqu'à 1-2 mm de la valeur réelle du MIC. Il est conseillé d'exécuter l'expérience en triplicate pour réduire ce problème.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incuber pendant 18-20 heures, 37oC.</li>
		<li>Lisez les résultats. Le MIC est mesuré comme la zone d'inhibition qui croise la bande d'essai antibiotique notée sur chaque bande de test Électronique respective (figure 2 B).</li>
		<li>Utilisez la formule pour la concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) (Équation 1) afin de déterminer la synergie.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig2.jpg"> Figure 2 : Détection du synergisme - test croisé. Résultats des tests de synergie antimicrobienne s'est fait au MIC de la pénicilline G et de la gentamicine sur le groupe G de Streptococcus avant (A) et après (B) l'incubation pendant la nuit à 37 oC 5 % CO2. Un angle de 90 degrés est formé entre les deux valeurs MIC individuelles (pénicilline G : 0,094 g/mL, gentamicine : 8 g/mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<ol start="6"><li>
Approche non croisée de test de synergie. Streptococcus groupe G, résistance à la pénicilline G et gentamicine.<ol>
<li>Placez la bande e-test au centre de la plaque MHA (Figure 3 A,D).</li>
		<li>Marquez l'endroit où la valeur MIC précédemment déterminée se trouvait sur chaque bande.</li>
		<li>Incuber pendant 1 heure à température ambiante.</li>
		<li>Jeter la bande d'essai E pour chaque plaque MHA (Figure 3 B,E).</li>
		<li>Placez la deuxième bande d'essai électronique (contenant un antibiotique différent) sur la zone de la bande enlevée antérieure respectivement afin que leurs valeurs MIC correspondent à la marque et soient alignées.</li>
		<li>Incuber pendant 18-20 heures, 37oC.</li>
		<li>Lisez les résultats. Le MIC est mesuré comme la zone d'inhibition qui croise la bande d'essai antibiotique notée sur chaque bande de test Électronique respective (figure 3 C,F).</li>
		<li>Afin de déterminer la synergie, la formule de concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) est utilisée (Équation 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig3.jpg"> Figure 3 : Détection du synergisme - test non croisé. Résultats des tests de synergie antimicrobienne s'estconcentré sur le MIC de la pénicilline G et de la gentamicine sur le groupe De Streptococcus G. A) bande de gentamicin (8 g/mL centré) au-dessus de la bactérie du groupe G de Streptococcus, B) Enlèvement de la bande de gentamicine, C ) Bande combinée de gentamicine / pénicilline G (0,094 g/mL centré) au-dessus de la bactérie Streptococcus groupe G, D) penicilline G bande (0,094 g/mL centré), E) Enlèvement de la penicilline G bande, F) Pénicilline combinée G / la bande de gentamicine (8 g/mL centré) sur le dessus des bactéries du groupe G de Streptococcus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
2. Test de bouillon
<ol><li>
arrangement
	<ol>
<li>Portez des gants et une blouse de laboratoire</li>
		<li>Préparer l'espace de travail en le stérilisant à l'aide de 70 % d'éthanol</li>
		<li>Recueillir 15mL de bouillon MH avec 50% de sang de cheval lysé et 20 mg/mL de NAD (MH-F)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(Facultatif) Effectuer un e-test [Protocole 1] pour déterminer le MIC sur le milieu solide
	<ol>
<li>Bien qu'elles soient facultatives, ces connaissances permettront une meilleure conception expérimentale (p. ex., les concentrations d'antibiotiques ajoutés peuvent être conçues pour entourer la valeur du MIC déterminée à partir de la plaque), ce qui améliorera les chances d'une expérience réussie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation d'un inoculum bactérien. Comme indiqué ci-dessus, la concentration bactérienne peut être estimée par des mesures OD nm ou des normes de turbidité McFarland<ol>
<li>
Méthode OD600 nm
		<ol>
<li>Obtenir une suspension bactérienne avec une concentration bactérienne établie</li>
			<li>Diluer la culture dans le bouillon MH-F pour obtenir un OD600 de 0,003</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Méthode de turbidité McFarland
		<ol>
<li>Mettre 15 ml de bouillon MH-F dans un tube stérile.</li>
			<li>Inoculer le bouillon MH-F avec des bactéries (d'une assiette) à un niveau McFarland. Vortex la solution vigoureusement. Verser la solution dans un plat stérile Petri.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des antibiotiques
	<ol>
<li>Déterminer la concentration d'antibiotiques souhaitées<ol>
<li>Identifier la valeur du MIC à partir du test E (p. ex. 0,125 g/mL pour la pénicilline G et 8 g/mL pour la gentamicine)</li>
			<li>Multipliez la valeur MIC de la plaque d'agar par 24-27, correspondant à quatre-sept dilutions en série 2x. Ce sera la concentration de départ d'antibiotiques. (ex. pour la pénicilline G, sept dilutions en série 2x : 0,125 g/mL x 27 à 16 g/mL; pour la gentamicine, quatre dilutions en série 2x 8 g/mL x 24 x 128 g/mL</li>
			<li>Multiplier la valeur de départ souhaitée 100x afin de déterminer générer une concentration en stock des antibiotiques (p. ex. stocks de 1,6 mg/mL de pénicilline G et de 12,8 mg/mL de gentamicine)</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer une concentration de 100x stocks d'antibiotiques en conséquence<ol>
<li>Dissoudre les antibiotiques dans 10mL d'eau autoclaved, et le vortex pour générer une solution de stock (par exemple 16 mg de pénicilline G et 128 mg de gentamicine pour créer les stocks ci-dessus)</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ajouter des bactéries aux puits microplaques
	<ol>
<li>Aliquot 200 le bouillon MH-F contenant des bactéries inoculum aux puits dans les 3 premières rangées d'une plaque de microtiter de 96 puits pour une expérience dans le triplicate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ajouter des antibiotiques aux puits microplaques
	<ol>
<li>Ajouter 200 l de bouillon MH-F supplémentaire avec des bactéries à la première colonne de puits (A1, B1, C1) pour porter le volume total à 400 l.</li>
		<li>Ajouter 4 ll de la concentration en stock d'antibiotiques à la première colonne de puits. Étant donné que l'échantillon contient 400 L, il se traduira par une dilution 100x des antibiotiques.</li>
		<li>Générez une dilution en série 2x en transférant 200 bactéries/antibiotiques de A1 à A2, jusqu'à A11. Pipet vigoureusement entre les dilutions. Répétez l'étape pour des lignes supplémentaires.</li>
		<li>Retirez 200 L de la colonne 11 afin que le volume final dans tous les puits soit de 200 l.</li>
		<li>Laissez la dernière colonne (A12, B12, C12) sans antibiotiques, comme contrôles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Déterminer les valeurs du MIC
	<ol>
<li>Incuber la plaque microtiter de 96 puits pendant 24 heures à 37oC sans trembler.</li>
		<li>La valeur du MIC est définie comme le dernier puits de la série de dilution qui ne présente aucune croissance visible des bactéries (figure 4). Cette valeur, cependant, ne peut être digne de confiance que si la taille d'inoculum d'origine était correcte.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig4.jpg"> Figure 4 : Détermination du MIC par dilution du bouillon. MIC est ici défini comme le dernier puits qui montre la clarté (pas de croissance des bactéries) avant qu'il ne change la turbidité. Les lignes sont des doublons de la valeur MIC de la pénicilline G et les lignes sont des doublons de la valeur MIC de la gentamicine, à la fois par rapport à un isolat du groupe Streptococcus G. A) résultat expérimental réel, B) interprétation schématique des valeurs de A ( gris et pas de croissance; blanc et la croissance). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig5.jpg"> Figure 5 : Procédure schématique de la série de dilution pour compter la concentration originale des bactéries. Les dilutions ont été effectuées telles que décrites (20 l diluées dans 180 l pour une série de dilution 10x), puis 10 L des rangées A-H sont plaquées sur deux plaques d'agar de sang distinctes comme indiqué. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<ol start="8"><li>
Déterminer la taille originale de l'inoculum REMARQUE: Les essais de microbroth sont très sensibles pour la taille originale d'inoculum utilisée. Une taille excessive d'inoculum donnera un résultat faussement positif, puisque les antibiotiques ajoutés ne pourront plus inhiber la croissance à ce ratio. Par conséquent, il est essentiel de vérifier combien de bactéries ont été ajoutées aux micropuits. Bien que les données ne soient pas disponibles au moment de l'expérience (en raison du besoin d'incubation de 24 heures), elles serviront de contrôle. Si le nombre de bactéries ajoutées se situe dans la plage de concentration indiquée, les valeurs MIC peuvent être fiables. Si l'inoculum était trop haut ou trop bas, l'expérience doit être répétée.<ol>
<li>
Diluer en série les bactéries
		<ol>
<li>Préparer une plaque de microtiter de 96 puits pour diluer la concentration bactérienne d'origine afin de déterminer la taille de l'inoculum. L'optimum est un volume de 200 L avec 105-6 bactéries. Pour effectuer les dilutions, d'abord aliquot 180 L stérile PBS à chaque puits en B-H (en triple1-3).</li>
			<li>Ensuite, ajoutez 100 'l de solution bactérienne à A (en triplicate 1-3).</li>
			<li>Générer une dilution en série 10x (en triplicate) en transférant 20 bactéries de A à B, pipet vigoureusement. Répétez les étapes pour C-H.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Plaquer les dilutions bactériennes pour la détermination de la taille de l'inoculum
		<ol>
<li>Marquez les plaques d'agar de sang selon la figure 5.</li>
			<li>Transférer 10 l de la dilution en série à la plaque selon la figure 5.</li>
			<li>Incuber la plaque à 37oC pendant 20-24 heures.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Déterminer la taille de l'inoculum bactérien
		<ol>
<li>Compter les nombres bactériens dans les endroits dans les colonies de 5-50 (figure 6).</li>
			<li>Calculer la taille initiale de l'inoculum en calculant la moyenne des échantillons triplicate, multiplier par le facteur de dilution (par exemple 10x pour les échantillons B, 100x pour les échantillons C, 1000x pour les échantillons D, etc.) et ensuite par 100 pour compenser le volume de repérage de 10 L, ce qui a pour résultat le taille de l'inoculum en cfu/mL. Si l'inoculum est dans 105-6 cfu/mL les données MIC peuvent être fiables.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig6.jpg"> Figure 6 : Détermination de la taille de l'inoculum. Les bactéries inoculées selon la figure 5 ont été incubées pendant 20-24 heures à 37oC, puis comptées. La rangée D compte un bon nombre de colonies (p. ex. 5-50). Les échantillons en A ne sont pas dilués, B est dilué 10x, C est dilué 100x, et D est dilué 1000x, et seulement 10 L est plaqué dans chaque endroit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

La résistance aux antibiotiques est un problème de santé mondial. Afin de déterminer les mécanismes de résistance des microbes, des méthodes de test de synergie et d'antagonisme avec différents antibiotiques sont cruciales. La méthode E-test est rapide, facile à reproduire, et peut être utilisée pour étudier n'importe quel potentiel synergique des thérapies combinées. La méthode de dilution du bouillon peut également être évaluée pour prédire l'activité bactéricide. Afin d'étudier les mécanismes de résistance de différen...

tests de sensibilité aux antibiotiques : utilisation du etest pour déterminer la cmi de deux antibiotiques et évaluer la synergie des antibiotiques

Source: Anna Blàckberg1, Rolf Lood1 1 Département des sciences cliniques Lund, Division de médecine de l'infection, Centre biomédical, Université de Lund, 221 00 Lund Suède
La connaissance des interactions entre les antibiotiques et les bactéries est importante pour comprendre comment les microbes évoluent la résistance aux antibiotiques. En 1928, Alexander Fleming découvre la pénicilline, un antibiotique qui exerce sa fonction antibactérienne en interférant avec la régénération de la paroi cellulaire (1). D'autres antibiotiques avec divers mécanismes d'action ont été découverts par la suite, y compris des médicaments qui inhibent la réplication de l'ADN et la traduction des protéines chez les bactéries; cependant, aucun nouvel antibiotique n'a été développé ces dernières années. La résistance aux antibiotiques actuels a augmenté, ce qui a entraîné des maladies infectieuses graves qui ne peuvent pas être traitées efficacement (2). Ici, nous décrivons plusieurs méthodes pour évaluer la résistance aux antibiotiques dans les populations bactériennes. Chacune de ces méthodes fonctionne, quel que soit le mécanisme d'action des antibiotiques utilisés, parce que la mort bactérienne est le résultat mesuré. La résistance aux antibiotiques est non seulement rapidement disséminée spécifiquement dans les milieux hospitaliers, mais aussi dans toute la société. Afin d'étudier de tels moyens de résistance, différentes méthodes ont été développées, y compris le test Epsilomètre (E-test) et le test de dilution du bouillon (3).
Le test électronique est une méthode bien établie et un outil rentable qui quantifie les données de concentration inhibitrice minimale (MIC), la plus faible concentration d'un antimicrobien qui inhibe la croissance visible d'un micro-organisme. Selon la souche bactérienne et les antibiotiques utilisés, la valeur du MIC peut varier entre le sous-g/mL et le 4. Le test Électronique est effectué à l'aide d'une bande de plastique contenant un gradient antibiotique prédéfini, qui est imprimé avec l'échelle de lecture du MIC en 'g/mL. Cette bande est directement transférée sur la matrice d'agar lorsqu'elle est appliquée sur la plaque d'agar inoculée. Après l'incubation, une zone d'inhibition elliptique symétrique est visible le long de la bande à mesure que la croissance bactérienne est empêchée. LE MIC est défini par la zone d'inhibition, qui est le point de terminaison où l'ellipse croise la bande. Une autre méthode courante pour déterminer LE MIC est la méthode de dilution des microbroths. La dilution du microbroth incorpore différentes concentrations de l'agent antimicrobien ajouté à un milieu bouillon contenant des bactéries inoculées. Après l'incubation, le MIC est défini comme la plus faible concentration d'antibiotiques qui empêche la croissance visible (5). Il s'agit également d'une méthode quantitative qui peut être appliquée à plusieurs bactéries. Les inconvénients de cette méthode comprennent la possibilité d'erreurs lors de la préparation des concentrations des réactifs et le grand nombre de réactifs requis pour l'expérience. La mesure de la résistance aux antibiotiques est impérative du point de vue clinique et de la recherche, et ces méthodes in vitro d'étude de la résistance sont discutées et présentées ci-dessous.
Le profil de résistance pour une bactérie spécifique peut être appliqué afin d'optimiser le traitement antibiotique afin de déterminer si un patient bénéficierait d'un traitement combiné par rapport à un traitement unique. Pour l'utilisation de plus d'un antibiotique à la fois, il est impératif de connaître leurs interactions les uns avec les autres et s'ils ont un effet additif, synergique ou antagoniste. Un effet additif peut être vu lorsque l'effet articulaire des antibiotiques équivaut à la puissance des antibiotiques individuels administrés à dose égale. La synergie entre les antibiotiques, d'autre part, est présente lorsque l'effet articulaire des antibiotiques est plus puissant que si le médicament serait administré seul (6). L'application de combinaisons de traitement antimicrobien est utilisée pour éviter l'apparition de la résistance aux antimicrobiens afin d'améliorer l'effet du traitement antibiotique individuel (7). La connaissance de l'antagonisme est également aussi importante pour prévenir l'utilisation inutile de combinaisons d'antimicrobiens. La méthodologie de test électronique offre des moyens simples et de plusieurs façons de déterminer la synergie et l'antagonisme possibles entre les différents agents antimicrobiens. Afin de faire face à la prolifération des agents pathogènes résistants aux antibiotiques, la connaissance des mécanismes synergiques et antagonistes possibles de certains antibiotiques est importante, ce qui entraîne une efficacité clinique et lutte contre la multirésistance aux médicaments.
La détermination de la synergie à l'aide des tests e peut être divisée en deux approches générales : les tests croisés et non croisés. Bien que les deux tests de synergie s'appuient sur la connaissance antérieure des valeurs individuelles du MIC, les deux approches sont légèrement différentes en méthodologie et en approche conceptuelle. Dans un test de synergie non croisé, le premier antibiotique de la paire à être testé est placé sur une plaque d'agar inoculée avec des bactéries. Après avoir permis aux antibiotiques de la première bande infuser la plaque (par exemple après 1 heure), la bande est enlevée et une nouvelle bande contenant le deuxième antibiotique est placé au même endroit que le premier, en veillant à placer les deux valeurs MIC individuelles sur le dessus de chaque ot son. La zone d'inhibition qui en résulte peut ensuite être analysée comme décrite ci-dessus, et la synergie calculée sur la base de l'équation 1.
Équation 1 - Concentrations inhibitrices fractionnelles (FIC)
<img src="/files/ftp_upload/10512/10512eq1.jpg">
Les valeurs de la marque sont des valeurs qui démontrent une synergie.
Tout en récompensant l'examinateur avec des plaques faciles à analyser, la méthode est un peu laborieuse et longue en raison du changement de bandes, ainsi que la nécessité d'utiliser deux plaques par expérience. Au lieu de cela, un test croisé est souvent utilisé. Au lieu d'ajouter les deux bandes d'essai E différentes par la suite sur l'autre (après<img align="center" src="/files/ftp_upload/10512/10512eq3.jpg">l'enlèvement de la première), les deux sont placés simultanément, mais sous la forme d'une croix (angle de 90 degrés), avec les deux valeurs MIC précédemment déterminées formant l'angle de 90 degrés. Par cette approche, une seule plaque est nécessaire par test de synergie, ainsi que moins de travail, ce qui en fait un choix préféré en dépit d'être un peu plus difficile à analyser. Les nouvelles valeurs du MIC dans l'approche combinée des antibiotiques peuvent être visualisées comme les zones d'inhibition modifiées, après quoi la synergie peut être déterminée par l'équation 1.
Au lieu d'utiliser une approche de plaque d'agar, une approche de microbroth peut souvent être préférentielle en raison de sa plus grande flexibilité (par exemple, la capacité de choisir des concentrations spécifiques d'antibiotiques en dehors des limites d'une bande de test électronique). En outre, les tests de microbroth sont suggérés pour être plus sensibles en raison de leur distribution uniforme d'antibiotiques dans une solution liquide, ne dépend pas de la dissociation dans une phase solide (plaque d'agar). Les puits dans une microplaque de 96 puits seront inoculés avec un nombre fixe de bactéries (106 cfu/mL : la concentration bactérienne peut être estimée par des mesures OD600 nm, des normes de turbidité, ou par des échantillons de placage de 10x dilutions bactériennes en série), et antibiotiques dans différentes dilutions seront ajoutés aux puits. De même, pour les bandes e-test MIC est déterminé comme l'intersection (bien / spot) avec la plus faible concentration d'antibiotiques inhibant la croissance visible des bactéries.
Objectif expérimental
<ul><li>Le projet ci-dessous décrit les stratégies visant à déterminer les valeurs MIC de la pénicilline G et de la gentamicine du groupe G de Streptococcus par deux méthodes différentes, le test électronique et la dilution du microbroth. Pour l'essai électronique, les plaques d'agar De Mueller-Hinton inoculées avec le groupe G de Streptococcus ont été employées en combination avec des bandes de gradient de la pénicilline G et/ou de la gentamicine ; tandis que MH-broth avec 50% de sang de cheval lysé et 20 mg/mL -NAD ont été utilisés avec des antibiotiques solubles avec streptocoque groupe G dans une approche de microbroth.</li>
</ul>Matériaux
<ul><li>Colonies bactériennes sur une plaque d'agar de sang, stockées 7 jours dans 4 oC</li>
	<li>Plaques d'agar de sang</li>
	<li>0.5 Norme McFarland<ul>
<li>1% BaCl2
</li>
		<li>1% H2SO4
</li>
	</ul>
</li>
	<li>Tube salin (2 mL)</li>
	<li>Applicateur à pointe de coton</li>
	<li>Plaques d'agar Mueller-Hinton (plaques MHA)</li>
	<li>Bouillon MH avec 50% de sang de cheval lysé et 20 mg/mL-NAD (MH-F)</li>
	<li>E-test pénicilline/gentamicin (ou antibiotiques d'intérêt) (BioMerieux, Marcy l'Etoile, France, Suède)</li>
	<li>Pénicilline/gentamicine (ou antibiotiques d'intérêt (poudre/solution))</li>
</ul>Remarque : Les médias spécifiques utilisés pour la croissance bactérienne peuvent varier selon les espèces.

Valeurs MIC en E-test Les valeurs du MIC individuel ont été identifiées à la figure 1 comme étant de 0,094 g/mL pour la pénicilline G et de 8 g/mL pour la gentamicine. Pour les tests de synergie, les deux ont démontré une valeur MIC pour la pénicilline G de 0,064 g/mL (Figures 2, 3), tandis que la gentamicine avait un MIC 4 g/mL pour les essais croisés et non croisés. Notez qu'un léger écart entre les tests croisés et non croisés peut se produ...

Tests de sensibilité aux antibiotiques : Utilisation du ETEST pour déterminer la CMI de deux antibiotiques et évaluer la synergie des antibiotiques

Source: Anna Bl&#228;ckberg1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 ...

La sensibilité aux antibiotiques est définie comme la sensibilité d’une bactérie aux antibiotiques et peut être mesurée à l’aide d’un test de dilution en bouillon ou d’un test Epsilometer, également appelé test E. Dans la méthode de dilution en bouillon, un nombre standardisé de bactéries est ajouté à un milieu de croissance contenant des dilutions d’antibiotiques en série. Si elles sont sensibles, les bactéries ne peuvent pas se développer aux concentrations d’antibiotiques les plus élevées, mais continuent de se multiplier aux concentrations d’antibiotiques les plus faibles, ce qui rend les milieux troubles. La concentration minimale d’antibiotiques à laquelle la bactérie ne peut plus survivre ou se multiplier est appelée la valeur minimale de concentration inhibitrice, ou CMI, de l’antibiotique pour la bactérie donnée. Dans un test E, une bande de plastique imprégnée d’un gradient prédéfini d’antibiotique est appliquée sur une pelouse de bactéries fraîchement répandue sur une plaque de Pétri gélifiée Mueller-Hinton, ou MH-A. L’antibiotique se diffuse dans le milieu gélosée, où il est absorbé par les bactéries. Si elles sont sensibles, les bactéries ne peuvent pas se multiplier et mourront, formant une zone claire autour de la bande E, appelée zone d’inhibition de la croissance. Au point où la croissance croise la bande E, la valeur correspondante sur l’échelle donne la valeur CMI de l’antibiotique. Souvent, les antibiotiques sont utilisés en combinaison pour prévenir l’émergence de souches de bactéries résistantes aux antibiotiques. Il en résulte souvent un effet synergique plutôt qu’additif. Synergique signifie que l’effet combiné des deux antibiotiques est supérieur à la somme de leurs activités individuelles. Cependant, l’effet n’est considéré comme significatif que lorsque la valeur de la CMI de l’association d’antibiotiques diminue d’au moins deux fois. Ce critère est évalué en calculant l’indice de concentration inhibitrice fractionnelle, ou FIC. En additionnant le rapport entre la CMI de chaque antibiotique et la CMI de chaque antibiotique individuellement, un indice FIC inférieur à 0,5 indique une synergie. La synergie antibiotique peut être mesurée à l’aide de deux méthodes basées sur le test E : un test non croisé ou un test croisé. Dans un test non croisé, les bandelettes E de deux antibiotiques différents avec des valeurs de CMI prédéterminées sont appliquées sur deux plaques distinctes. Une fois que les antibiotiques se sont diffusés dans le milieu, les bandelettes E d’origine sont retirées et les bandelettes E pour les antibiotiques alternatifs sont placées de manière à ce que leurs échelles de CMI reposent exactement sur les échelles de CMI des bandelettes précédentes. Dans un test croisé, qui est une version plus rapide du test non croisé, les bandelettes E des deux antibiotiques sont placées ensemble en formation croisée, de sorte que les écailles de leurs marques MIC forment un angle de 90 degrés à l’intersection. Après l’incubation dans les deux techniques, la valeur de la CMI de chaque antibiotique en combinaison avec l’autre antibiotique est lue au point où la zone d’inhibition de la croissance croise le bord de la bandelette E. Ensuite, l’indice FIC est calculé. Cette vidéo montrera comment déterminer la valeur de la CMI d’un antibiotique donné pour une bactérie donnée à l’aide d’un test E et d’un test de dilution de micro-bouillon. Vous apprendrez également à déterminer la synergie entre deux antibiotiques à l’aide d’un test croisé et d’un test non croisé. Pour commencer, enfilez tout équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants de laboratoire et une blouse de laboratoire. Ensuite, stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, prélevez 15 millilitres de bouillon stérile Mueller-Hinton avec 50 % de sang de cheval lysé et 20 milligrammes par millilitre de bêta-nicotinamide. Et cinq à huit plaques de gélose Mueller-Hinton. Maintenant, pour préparer un étalon de turbidité McFarland numéro 0,5, mesurez 9,95 millilitres d’une solution d’acide sulfurique à 1 %. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de solution de chlorure de baryum à 1 % à la solution d’acide sulfurique. Vortex bien la solution pour obtenir une suspension trouble. Couvrez le tube de papier d’aluminium et mettez-le de côté. Ensuite, versez un millilitre de solution saline dans un tube de 15 millilitres. Utilisez une boucle stérile pour prélever un échantillon de la croissance bactérienne de votre plaque de test bactérienne, ici, Streptococcus groupe G. Ensuite, placez la boucle chargée de bactéries dans la solution saline, remuez doucement, puis agitez bien le tube. Maintenant, placez la suspension bactérienne et les étalons de turbidité McFarland côte à côte et comparez-les pour l’équivalence de turbidité. Ajoutez des colonies salines ou bactériennes supplémentaires jusqu’à ce que la turbidité de la suspension bactérienne corresponde à celle de l’étalon. Une fois la turbidité souhaitée obtenue, trempez un applicateur à embout en coton stérile dans la suspension bactérienne. Pour inoculer la plaque MH-A, frottez doucement toute la surface de la plaque avec un mouvement en zigzag. Ensuite, étiquetez les côtés inférieurs des plaques avec le nom de la bactérie et la date. Pour commencer, sortez une bandelette de test E à la pénicilline G en la tenant par le bord avec une pince. Placez délicatement la bande au centre de la plaque MH-A fraîchement tamponnée et replacez le couvercle. Dans cet exemple, un deuxième antibiotique, la gentamicine, est également testé. Ainsi, le processus de mise en place de la bandelette est répété avec la deuxième plaque et une bandelette de test E de gentamicine. Pour déterminer les résultats du test E, prélevez la première plaque contenant la bandelette de test E de pénicilline G. Maintenant, déterminez le point où la zone d’inhibition croise la bande antibiotique. Lire la valeur numérique correspondante sur l’échelle. Cette valeur représente la valeur CMI de la pénicilline G. Déterminez la valeur CMI de la gentamicine de la même manière. Pour commencer, inoculez une plaque MH-A avec des bactéries de la souche Streptococcus du groupe G. Étiquetez le bas de l’assiette avec le nom de la bactérie, les antibiotiques à utiliser et la date. Maintenant, placez une bandelette de test E pour l’antibiotique d’intérêt au centre de la plaque. Ensuite, tenez la deuxième bandelette de test à un angle de 90 degrés par rapport à la première bande et localisez sa marque MIC. Posez doucement la deuxième bande E sur la première au point d’intersection des deux valeurs MIC. Une fois les bandes placées, ne les déplacez pas. Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures. Après avoir inoculé deux plaques MH-A, avec des bactéries de la souche G, placez une bandelette de test E pour un antibiotique sur la surface d’une plaque. Ensuite, placez une bandelette de test E pour l’autre antibiotique sur la deuxième plaque, comme indiqué. À l’aide d’une boucle d’inoculation en plastique, marquez la valeur CMI de chaque antibiotique sur la surface de sa plaque respective. Ensuite, couvrez les assiettes et incubez-les à température ambiante pendant une heure. Après cela, utilisez une pince pour retirer les bandes E. Ensuite, récupérez l’une des plaques et une bandelette de test E pour l’autre antibiotique. Tenez la bandelette de test E sur l’empreinte laissée par la première bande et localisez le point où la valeur MIC sur la bande E s’aligne avec la ligne marquée. Placez délicatement la bande à ce point d’intersection. Répétez ce processus pour la deuxième assiette et incubez les deux plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures. Tout d’abord, obtenir une suspension bactérienne avec une concentration bactérienne établie et diluer la culture dans un bouillon MHF pour obtenir une DO 600 de 0,003. Ensuite, pesez 16 milligrammes de pénicilline G et 128 milligrammes de gentamicine. Transférez chaque antibiotique sec pesé dans des tubes coniques de 215 millilitres. Ajoutez 10 millilitres d’eau distillée dans chacun des tubes coniques et mélangez bien par vortex. Étiquetez les tubes avec le nom et la concentration de l’antibiotique. En effectuant le test en trois exemplaires, ajoutez 400 microlitres de la solution bactérienne de travail dans les premiers puits de trois rangées d’une plaque de microtitration de 96 puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de la solution bactérienne de travail dans du bouillon MHF dans les puits des trois rangées. Maintenant, pour générer une dilution d’antibiotique en série deux fois, ajoutez d’abord quatre microlitres de stock d’antibiotiques dans le premier puits, générant une dilution de 100 fois. Séquentiellement, transférez 200 microlitres de solution bactério-antibiotique dans chaque puits, en commençant par le premier puits jusqu’au deuxième pour durer bien dans chaque rangée, assurez-vous d’un bon mélange en pipetant deux à trois fois après chaque transfert. Jetez les 200 derniers microlitres de solution bactérie-antibiotique. Pour déterminer les résultats de l’essai de microdilution en bouillon pour la pénicilline G, il faut d’abord localiser les puits qui ne présentent aucune croissance bactérienne visible, indiquée par une absence de turbidité. À partir de ces puits, identifiez le puits avec la plus faible concentration d’antibiotiques. Il s’agit de la valeur CMI de la pénicilline G pour les bactéries testées. La valeur CMI de la gentamicine peut être déterminée à l’aide du même dosage et de la même technique. Pour déterminer les résultats de l’essai non croisé, prélevez la première plaque, qui contient une bandelette G E de pénicilline. Ensuite, déterminez le point où la zone d’inhibition de la croissance croise la bande antibiotique. La valeur correspondante sur l’échelle représente la valeur CMI de la pénicilline G en association avec la gentamicine. Dans cet exemple, la valeur MIC combinée est de 0,064 microgramme par millilitre. Maintenant, prélevez la deuxième plaque, qui contient la bande de gentamicine E, et déterminez la valeur MIC en combinaison comme démontré précédemment. Pour évaluer l’effet de l’association, calculez d’abord la concentration inhibitrice fractionnée ou FIC pour la pénicilline G en divisant la CMI en combinaison par la CMI de l’antibiotique seul. Répétez ce processus pour la gentamicine. Ensuite, calculez l’indice FIC à l’aide de l’équation illustrée ici. Une réduction de deux fois de la valeur de la CMI en combinaison donne une valeur d’indice FIC inférieure ou égale à 0,5 et démontre une synergie entre la pénicilline G et la gentamicine. Dans ce cas, la valeur FIC calculée est de 1,18, ce qui est supérieur à 0,5. Ainsi, les résultats ne démontrent pas de synergie entre la pénicilline G et la gentamicine contre la souche du groupe G du streptocoque. Pour déterminer les résultats de l’essai croisé, il faut d’abord déterminer le point d’intersection des zones d’inhibition de la croissance avec leurs bandes E respectives. Lisez la valeur numérique sur chaque bandelette E-test qui correspond à ce point d’intersection. Ces valeurs représentent la valeur CMI en combinaison pour la pénicilline G et la gentamicine. Ensuite, pour évaluer l’effet de la combinaison, calculez l’indice FIC à l’aide de l’équation illustrée ici. Dans cet exemple, la valeur FIC calculée est de 1,18, ce qui est supérieur à 0,5. Cela signifie que la pénicilline G et la gentamicine n’agissent pas en synergie contre la souche du groupe G du streptocoque.

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measuring bacterial resistance with e-tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform.

The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with bacteria, and the MIC scale is printed directly on the strip in micrograms per milliliter. After incubation, an ellipse-shaped zone appears where growth is blocked. The MIC is read where that inhibition zone meets the strip.

A similar MIC method is microbroth dilution. In this approach, bacteria are placed in broth with different antibiotic concentrations. After incubation, the MIC is the lowest concentration that still stops visible growth. This method is quantitative and can be used with several bacteria, although it can require many reagents and careful preparation of the concentrations.

Knowing a bacterium’s resistance profile can help guide treatment choices. It can show whether a patient may benefit from one antibiotic or from a combination. When two antibiotics are used together, they may act in an additive, synergistic, or antagonistic way. Additive means the combined effect matches the effect of each drug at equal dose, while synergy means the combined effect is stronger than either drug alone.

E-tests can also be used to look for synergy and antagonism between antimicrobial agents. One method is non-cross testing. In this setup, one antibiotic strip is first placed on the agar plate, allowed to diffuse, and then removed. A second strip is placed in the same position, with the two MIC values aligned, and the result is used to calculate the fractional inhibitory concentration, or FIC. Values above 0.5 show synergy. This method is simple to read, but it takes more time and uses two plates.

A faster option is the cross test. Here, both E-test strips are placed at the same time in a 90-degree cross, with the known MIC values meeting at the angle. Only one plate is needed, so the method saves work, although the result can be a little harder to analyze. The changed inhibition zones are then used to determine whether the antibiotics act synergistically.

A broth-based approach can also be used for combination testing. It gives more flexibility because specific antibiotic concentrations can be chosen outside the limits of an E-test strip. It may also be more sensitive because the antibiotics are evenly distributed in liquid, rather than relying on diffusion through agar. In this method, wells in a 96-well plate are filled with a set number of bacteria and different antibiotic dilutions, and the MIC is the lowest concentration that prevents visible growth.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

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creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

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Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

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Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Cette collection présente les outils clés pour la recherche en microbiologie, y compris le maintien d'un environnement stérile et les techniques d'ensemencement, l'utilisation de milieux sélectifs et l'enrichissement des échantillons, ainsi que les méthodes de culture pour les échantillons mixtes ou purs. Cette collection inclut aussi les méthodes courantes d'identification des isolats microbiens, ainsi que les techniques de manipulation génétique des bactéries.

Learn how E-tests and microbroth dilution measure MIC values, and how cross and non-cross setups reveal antibiotic synergy in bacteria.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests | JoVE K12

Georgia Standards of Excellence

9-12

Biology

SB6.e

Anna Bläckberg

Rolf Lood

Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center

Lund University

Concepts

Preparation of Plates and Bacteria

Determining MIC Using E-Test

Synergy Testing: Cross Approach

Synergy Testing: Non-Cross Approach

MIC Determination Using Broth Dilution

Data Analysis: Broth Microdilution

Data Analysis and Results: Synergy Testing

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

DNA Base Pairing

Erwin Chargaff&#x2019;s rules on DNA equivalence paved the way for the discovery of base pairing in DNA. Chargaff&#x2019;s rules state that in a ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

The Central Dogma

The central dogma explains the flow of genetic information from DNA nucleotides to the amino acid sequence of proteins.
RNA is the Missing Link Between ...

Genomic DNA in Prokaryotes

The genome of most prokaryotic organisms consists of double-stranded DNA organized into one circular chromosome in a region of cytoplasm called the ...

Genomic DNA in Eukaryotes

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. To fit their genomes into a cell, eukaryotic DNA is packaged extraordinarily tightly inside the ...

Overview

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most ...

DNA Packaging

Overview

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. In order to fit their genomes into a cell, eukaryotes must pack their DNA tightly inside ...

RNA Structure

Overview
The basic structure of RNA consists of a five-carbon sugar and one of four nitrogenous bases. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

RNA Stability

Intact DNA strands can be found in fossils, while scientists sometimes struggle to keep RNA intact under laboratory conditions. The structural variations ...

pre-mRNA Processing

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Types of RNA

Overview
Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs ...

DNA as a Genetic Template

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

What are Cells?

Cell Diversity

The concept of a cell started with microscopic observations of dead cork tissue by Robert Hooke in 1665. Hooke coined the term &#34;cell&#34; based on the ...

Cells of the Epidermis

The epidermis is made of four or five layers of epithelial cells, depending on its location in the body. From deep to superficial, these layers are the ...

Bone Cells and Tissue

Bones contain a relatively small number of cells entrenched in a matrix of organic and inorganic components. Although bone cells compose only a small ...

Gross Anatomy of Skeletal Muscles

The connective tissues play a significant role in arranging the muscle fibers into a hierarchical structure that forms a complete muscle. Consider a ...

Structure of Cardiac Muscles

Cardiac muscle, or myocardium, is a specialized type of muscle found exclusively in the heart. Its unique structural and functional characteristics enable ...

structure-and-organization-of-smooth-muscles

Structure and Organization of Smooth Muscles

In the human body, smooth muscle tissue is found lining the visceral and tubular organs such as the liver, lungs, blood vessels, and respiratory tract.
...

Chromosome Replication

Before a cell can divide, it must accurately replicate all of its chromosomes, including the DNA and its associated histone and non-histone ...

Neurons: The Cell Body and the Dendrites

A typical nerve cell comprises three main components: the cell body, dendrites, and the axon. The cell body, also known as the soma or perikaryon, serves ...

Lampbrush Chromosomes

In 1882, Flemming observed lampbrush chromosomes (LBC) in salamander eggs. Later in 1892, R&#252;ckert observed LBCs in shark egg cells and coined the ...

Neurons: The Axon

The axon is a long, thin extended portion of the neuron that carries impulses from its cell body toward the effector cell.
Axoplasm, the axon&#39;s ...

Polytene Chromosomes

Polytene chromosomes are giant interphase chromosomes with several DNA strands placed side by side. They were discovered in the year 1881 by Balbiani in ...

Nervous Tissue: Neuron Types

Neurons, the fundamental units of the nervous system, can be classified based on both their structural and functional characteristics.
Structurally, ...

Euchromatin

The extent of chromatin compaction can be studied by staining chromatin using specific DNA binding dyes. Under the microscope, the dense-compacted regions ...

Nervous Tissue: Glial Cells

Glial cells or neuroglia are non-neuronal cells in the nervous system that outnumber neurons. These include astrocytes, oligodendrocytes, microglia, and ...

Heterochromatin

Lymphoid Cells and Tissues

Lymphoid cells and lymphoid tissues are the two major components of lymphoid organs.
Lymphoid cells consist of immune system cells such as B and T ...

chromatin-position-affects-gene-expression

Chromatin Position Affects Gene Expression

Chromatin is the massive complex of DNA and proteins packaged inside the nucleus. The complexity of chromatin folding and how it is packaged inside the ...

Two structural features of the DNA molecule provide a basis for the mechanisms of heredity: the four nucleotide bases and its double-stranded nature. The ...

Organization of Genes

Chromosome Structure

A functional eukaryotic chromosome must contain three elements: a centromere, telomeres, and numerous origins of replication.
The centromere is a DNA ...

Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells. Emphasis is on the conceptual understanding that DNA sequences determine the amino acid sequence and thus protein structure. Students can produce scientific writing, or presentations, and/or physical models that communicate constructed explanations.

HS-LS1-1

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

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Levels of Organization

Biological organization is the classification of biological structures, ranging from atoms at the bottom of the hierarchy to the Earth&#x27;s biosphere. ...

The Scientific Method

The scientific method is a detailed, empirical problem-solving process used by biologists and other scientists. This iterative approach involves ...

Taxonomy

Taxonomy is the science of defining and naming groups of biological organisms based on shared characteristics. It uses a hierarchy of increasingly ...

Phylogeny

Phylogeny is concerned with the evolutionary diversification of organisms or groups of organisms. A group of organisms with a name is called a taxon ...

Develop and use a model to illustrate the hierarchical organization of interacting systems that provide specific functions within multicellular organisms. Emphasis is on functions at the organism system level such as nutrient uptake, water delivery, or organism movement in response to neural stimuli. An example of an interacting system could be an artery depending on the proper function of elastic tissue and smooth muscle to regulate and deliver the proper amount of blood within the circulatory system.

HS-LS1-2

Overview of Metabolism

Living cells constantly carry out various chemical reactions which are necessary for their proper functioning. These reactions are interlinked to one ...

Regulation of Metabolism

Cellular needs and conditions vary from cell to cell and change within individual cells over time. For example, the required enzymes and energetic demands ...

Positive and Negative Feedback Loops

Animal organs and organ systems constantly adjust to internal and external changes through a process called homeostasis (&#34;steady state&#34;). Examples ...

Functions of Life

Human life is characterized by a variety of functions that are essential for survival and well-being. These functions include metabolism, movement, ...

Requirements for Human Life

The Earth and its atmosphere have provided humans with air, water, and food, but these are not the only requirements for survival. Humans also require a ...

What is Homeostasis?

Maintaining homeostasis requires that the body continuously maintain its internal conditions. Each physiological condition has a particular set point, ...

Negative and Positive Feedback

Plan and conduct an investigation to provide evidence that feedback mechanisms maintain homeostasis in living organisms. Examples of investigations could include heart rate responses to exercise, stomate responses to moisture and temperature, root development in response to water levels, or cell response to hypertonic and hypotonic environments.

HS-LS1-3

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

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