Name: calcium chloride dna uptake in e. coli
Uploaded: 2023-04-30T07:10:31.000Z
Duration: 10 min 54 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Florida Department of Education

High School

Life Science

SC.912.L.16

SC.912.L.16.7

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

Ce protocole décrit la préparation et la transformation de e. coli DH5compétent compétent à l'aide d'une adaptation de la procédure de chlorure de calcium (12).
1. Mise en place
<ol><li>
équipement
	<ul>
<li>Spectrophotomètre</li>
		<li>Sorval Centrifuge (ou équivalent)</li>
		<li>Centrifugeuse benchtop</li>
		<li>Bloc de chaleur ou bain d'eau</li>
		<li>Shaker orbital</li>
		<li>Incubateur stationnaire</li>
		<li>Plateau de coulée de gel</li>
		<li>Peignes de puits</li>
		<li>Source de tension</li>
		<li>Boîte de gel</li>
		<li>Source de lumière UV</li>
		<li>micro-ondes</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Solutions et réactifs
	<ul>
<li>Bouillon Luria-Bertani (LB) (10 g d'hydrolysate enzymique de caséine, 5 g d'extrait de levure et 5 g de chlorure de sodium en 1000 ml de H2O)</li>
		<li>Super Optimal bouillon avec répression Catabolite (SOC): (2% (w/v) tryptone, 0.5% (w/v) extrait de levure, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, et 20 mM de glucose)</li>
		<li>CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) solution.</li>
		<li>M CaCl2 solution (si les cellules seront transformées immédiatement) ou 0,1 M CaCl2 solution contenant 10% (v / v) de glycérol (si les cellules seront congelées pour une utilisation future).</li>
		<li>Plaques d'agar LB</li>
		<li>Plaques sélectives lb agar (pour cette expérience, puisque le plasmide utilisé confère une résistance à l'ampicilline, des plaques d'agar LB contenant de l'ampicilline 100 g/mL ont été utilisées)</li>
		<li>
Souche E. coli DH5MD</li>
		<li>Plasmid pUC19 ADN (100 pg/ l)</li>
		<li>Kit miniprep QIAprep Spin (Qiagen)</li>
		<li>
Hind Hind ENZYME de restriction III</li>
		<li>1 kb plus échelle d'ADN</li>
		<li>Point de fusion basse Agarose</li>
		<li>1X tampon TAE (40 mM Base Tris, 20 mM d'acide acétique et 1 mm EDTA)</li>
		<li>Bromure d'ethidium (10mg/mL)</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Notes générales de sécurité E. coli DH5MD est classé niveau de biosécurité 1 (BSL1). Les microbes de cette catégorie présentent peu ou pas de menace d'infection chez les adultes en bonne santé. Cependant, une manipulation soigneuse du micro-organisme est nécessaire.</li>
</ol>IMPORTANT toutes les étapes de ce protocole doivent être effectuées à l'aide de techniques aseptiques et sur la glace ou des températures de 4 oC, sauf indication contraire.
2. Protocole
<ol><li>À partir d'un stock congelé d'E. coli DH5MD (congelé à 20 % de glycérol à partir d'une culture de nuit cultivée en LB), les bactéries s'écriapour l'isolement sur une plaque d'agar LB. Incuber à 37oC pendant la nuit (16-20 heures).</li>
	<li>Inoculer une seule colonie en 3 ml de bouillon LB dans un tube. Croissance en secousses à 210 tr/min à 37 oC pendant la nuit (16-20 heures).</li>
	<li>Mesurer l'OD600 de la culture du jour au lendemain. Utilisez la culture de la nuit pour inoculer 100 ml de bouillon LB dans un flacon de 1 litre à un OD600-0,01. Incuber la culture en secouant vigoureusement (210 tr/min) à 37 oC de surveillance OD600 dans le spectrophotomètre toutes les 15-20 min, jusqu'à ce que la culture atteigne OD600-0,35 (environ 3 heures). REMARQUE : Pour que la transformation soit efficace, les cellules bactériennes doivent être en phase de croissance à mi-exponentielle. Le nombre maximal de cellules doit être de 108 cellules/mL, ce qui correspond pour la plupart des souches d'E. coli à OD600-0,4. L'utilisation du spectrophotomètre permet de mesurer l'OD600, ce qui permet de déterminer que les cellules sont au stade de croissance approprié. Si ce protocole sera utilisé pour d'autres souches de bactéries, l'étalonnage pour déterminer le nombre de colonies formant des unités à des valeurs OD600 spécifiques sera nécessaire pour déterminer cette corrélation.</li>
	<li>Transférer les 50 ml de la culture à chacune des 2 bouteilles de centrifugeuse en polypropylène glacée. Placer les bouteilles sur la glace pendant 20 min pour refroidir.</li>
	<li>Récupérer les cellules par centrifugation à 2700g (4100 tr/min dans un rotor Sorval GSA) pendant 10 min à 4oC.</li>
	<li>Retirez le supernatant. Égoutter les dernières traces de supports en plaçant la bouteille à l'envers sur un tampon ou un essuie-tout.</li>
	<li>Resuspendre chaque granule bactérien en 30 ml d'une solution caCl2-MgCl2 (80 mM MgCl 2 , 20 mM CaCl2) solution glacée. D'abord ajouter 5 ml de la solution, tourbillonner soigneusement jusqu'à ce que le granule soit complètement dissous, puis ajouter les 25 ml de solution restantes.</li>
	<li>Répétez l'étape 2.4.</li>
	<li>Répétez l'étape 2.5.</li>
	<li>Si des cellules compétentes doivent être transformées directement, resuspendre chaque granule bactérienne en 2 ml d'une solution de glace CaCl2 (0,1 M) en faisant tourbillonner soigneusement les tubes. Si le granule n'est pas suspendu avec cette méthode, resuspendre en pipetting doucement de haut en bas (en évitant la formation de bulles). Alternativement, les cellules compétentes peuvent être congelées et stockées pour une utilisation ultérieure. Pour préparer les stocks congelés de cellules compétentes, suspendre la pastille dans 2 ml d'une solution De 0,1 M CaCl2 contenant 10 % (v/v) de glycérol. Cette solution doit être glacée. Suspension des cellules D'Aliquot en tubes de polypropylène de 1,5 ml de glace (160 l par tube). Congelez immédiatement les cellules compétentes dans un bain de glace sèche/éthanol. Transférer les tubes dans un congélateur à -70 oC.</li>
	<li>Pour transformer les cellules traitées CaCl2,transférez 50 'l de cellules compétentes à chacune des 2 tubes de polypropylène de 1,5 ml. Ajouter l'ADN plasmide de 1 x l (100 pg) à l'un des tubes et laisser le deuxième tube sans ADN (contrôle négatif). Mélanger délicatement (éviter la formation de bulles). Incuber 30 min sur glace. REMARQUE : Pas plus de 50 ng d'ADN dans un volume de 10 L ou moins doivent être utilisés dans la transformation.</li>
	<li>Transférer les tubes dans le bloc de chaleur et couver à 42oC pendant 45 s exactement. REMARQUE : Le choc thermique est une étape critique. Ne dépassez pas la température ou le temps d'incubation.</li>
	<li>Transférer facilement les tubes sur la glace. Incuber pendant 2 min.</li>
	<li>Ajouter 950 l de milieux SOC et couver les tubes pendant 1 heure à 37oC pour permettre aux bactéries de récupérer et exprimer le marqueur résistant aux antibiotiques encodé dans le plasmide.</li>
	<li>Diluer 10 l de la suspension cellulaire en 1000 l en SOC (1/100 dilution) et 100 oL de la suspension cellulaire en 1000 l l en SOC (1/10 dilution). Plaque 100 'l des dilutions, ainsi que le contrôle, sur les plaques sélectives, et répartis à l'aide d'une spatule. Habituellement, le placage de 100 l d'une dilution de 1/100 et 1/10 donnera un nombre suffisant d'unités de formation de colonies (cfu) par plaque. Idéalement, ce nombre devrait varier entre 30-300 cfu de sorte qu'il y ait assez de colonies mais séparées les unes des autres. Toutefois, le nombre de cfu dépendra de l'efficacité de la transformation (voir la Section analyse des données et résultats).</li>
	<li>Incuber les plaques à 37oC. Les colonies transformées devraient apparaître en 12-16 heures (cette plage dépendra de la souche cellulaire et de la méthode de sélection). Aucune colonie ne devrait se développer dans le contrôle négatif.</li>
	<li>Compter le cfu/plaque obtenu pour la transformation (Tableau 1).</li>
	<li>Pour vérifier les transformateurs hébergent le plasmide pUC19, une préparation plasmide et une digestion ultérieure seront effectuées. À cette fin, inoculer une seule colonie en 3 ml de bouillon LB dans un tube. Croissance en secousses à 210 tr/min à 37 oC pendant la nuit (16-20 heures).</li>
	<li>Préparer une préparation plasmide à l'aide de la trousse QIAprep Spin Miniprep, selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Diger le 1 g de pUC19 purifié avec l'enzyme de restriction HindIII à 37 oC pendant 1 heure. REMARQUE: Toute enzyme qui coupe dans le site de clonage multiple pUC19 peut être utilisé pour cette étape.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>composant</td>
			<td>quantité</td>
		</tr>
<tr>
<td>10X Tampon de digestion de restriction</td>
			<td>2,5 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Plasmid pUC19</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Hind Hind Ⅲ</td>
			<td>1 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>20,5 l (à 25 l)</td>
		</tr>
</tbody></table><ol start="21"><li>Exécutez une échelle de poids moléculaire, de l'ADN pUC19 digéré et la même quantité d'ADN pUC19 non digéré dans un gel d'agarose de 1 % contenant 1 bromure d'éthidium de g/mL pendant 1 heure à 95 V. REMARQUE : le temps et la tension varient selon l'équipement utilisé.</li>
	<li>Visualisez le gel sous la lumière UV. Comparez la taille de l'ADN pUC19 digéré et non digéré (figure 2) (voir la Section analyse des données et résultats). Procédez aux étapes nécessaires pour vérifier la transformation en fonction de l'objectif de chaque expérience de transformation particulière.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig2.jpg"> Figure 2 : Digestion de l'ADN plasmide récupéré à partir de cellules DH5 Transformées. L'ADN de Plasmid a été récupéré à partir de cellules DH5 transformées, digérées avec HindIII, exécutés dans un gel d'agarose de 1% et visualisés avec une source UV (étapes 2.19 à 2.22).
3. Analyse des données et résultats
Pour calculer l'efficacité de transformation, un indicateur de la façon dont les cellules ont pris l'ADN extracellulaire, les colonies obtenues dans la transformation doivent être comptés:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>dilution</td>
			<td>Ufc</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/100</td>
			<td>34</td>
		</tr>
<tr>
<td>1/10</td>
			<td>246</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Unités de formation de colonies (cfu) comptées à partir de l'expérience de transformation.
L'efficacité de transformation (TE) est une mesure du nombre de cfu résultant de la transformation de 1 g de plasmide en un volume donné de cellules compétentes. De nombreux paramètres affectent l'efficacité de la transformation : taille plasmique, génotype cellulaire, stade de croissance lors de la préparation des compétences, méthodes de transformation, etc.). Lors du calcul de l'TE est important de considérer quelle dilution (le cas échéant) a été effectuée avant le placage et de l'intégrer dans le calcul du nombre total de cfu. L'efficacité de transformation (TE) est calculée avec l'équation suivante :
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq1.jpg">
D'abord diviser le cfu par le g d'ADN, dans cet exemple 0,0001g. Divisez ensuite le résultat par le facteur de dilution. Dans cet exemple, une dilution de 1/10 a été utilisée et 100 'L d'une solution de 1 ml a été plaquée (dilution: 1/10 '100 'L /1000 'L '0.01).
<img src="/files/ftp_upload/10515/10515eq2.jpg">

La transformation est une méthode puissante pour introduire l'ADN exogène dans les cellules bactériennes qui est la clé de nombreuses applications de biologie moléculaire en laboratoire. En outre, il joue un rôle majeur dans la nature en permettant aux cellules bactériennes d'échanger du matériel génétique qui pourrait entraîner une variation génétique accrue et permettre l'acquisition de différents traits bénéfiques pour la survie dans un large éventail de conditions. De nombreuses souches bactériennes codent les gènes ...

transformation des cellules e. coli en utilisant le chlorure de calcium

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, et Victor J. DiRita1 1 Département de microbiologie et de génétique moléculaire, Michigan State University
Les bactéries ont la capacité d'échanger du matériel génétique (acide déoxyribonucléique, ADN) dans un processus connu sous le nom de transfert horizontal de gènes. L'incorporation d'ADN exogène fournit un mécanisme par lequel les bactéries peuvent acquérir de nouveaux traits génétiques qui leur permettent de s'adapter aux conditions environnementales changeantes, telles que la présence d'antibiotiques ou d'anticorps (1) ou de molécules présentes dans les habitats naturels (2). Il existe trois mécanismes de transfert horizontal de gènes : la transformation, la transduction et la conjugaison (3). Ici, nous allons nous concentrer sur la transformation, la capacité des bactéries à prendre l'ADN libre de l'environnement. En laboratoire, le processus de transformation comporte quatre étapes générales : 1) Préparation de cellules compétentes, 2) Incubation de cellules compétentes avec ADN, 3) Récupération des cellules, et 4) Placage des cellules pour la croissance des transformateurs (figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10515/10515fig1.jpg"> Figure 1 : Étapes générales du processus de transformation. Le processus de transformation comporte quatre étapes générales : 1) Préparation de cellules compétentes, 2) Incubation avec ADN, 3) Récupération des cellules et 4) Cellules de placage pour la croissance des transformateurs.
Pour que la transformation se produise, les bactéries récepteuses doivent être dans un état connu sous le nom de compétence. Certaines bactéries ont la capacité de devenir naturellement compétentes en réponse à certaines conditions environnementales. Cependant, beaucoup d'autres bactéries ne deviennent pas compétentes naturellement, ou les conditions pour ce processus sont encore inconnues. La capacité d'introduire l'ADN dans les bactéries a une gamme d'applications de recherche: pour générer plusieurs copies d'une molécule d'ADN d'intérêt, d'exprimer une grande quantité de protéines, comme un composant dans les procédures de clonage, et d'autres. En raison de la valeur de la transformation à la biologie moléculaire, il existe plusieurs protocoles visant à rendre les cellules artificiellement compétentes lorsque les conditions de compétence naturelle sont inconnues. Deux méthodes principales sont utilisées pour préparer des cellules artificiellement compétentes : 1) par le traitement chimique des cellules et 2) l'exposition des cellules aux impulsions électriques (électroporation). Le premier utilise différents produits chimiques selon la procédure pour créer une attraction entre l'ADN et la surface cellulaire, tandis que le second utilise des champs électriques pour générer des pores dans la membrane cellulaire bactérienne par laquelle les molécules d'ADN peuvent entrer. L'approche la plus efficace pour la compétence chimique est l'incubation avec des cations divalentes, plus particulièrement le calcium (Ca2)(4,5) La compétence induite par le calcium est la procédure qui sera décrite ici (6). Cette méthode est principalement utilisée pour la transformation des bactéries Gram-négatives, et qui sera au centre de ce protocole.
La procédure de transformation chimique implique une série d'étapes dans lesquelles les cellules sont exposées à des cations pour induire la compétence chimique. Ces étapes sont ensuite suivies d'un changement de température - choc thermique - qui favorise l'apport d'ADN étranger par la cellule compétente (7). Les enveloppes de cellules bactériennes sont chargées négativement. Chez les bactéries Gram-négatives comme Escherichia coli, la membrane externe est chargée négativement en raison de la présence de lipopolysaccharide (LPS) (8). Il en résulte la répulsion des molécules d'ADN de même charge négative. Dans l'induction chimique de compétence, les ions de calcium positivement chargés neutralisent cette répulsion de charge permettant l'absorption d'ADN sur la surface de cellules (9). Le traitement du calcium et l'incubation avec de l'ADN se font sur la glace. Par la suite, une incubation à des températures plus élevées (42 oC), le choc thermique, est effectuée. Ce déséquilibre de température favorise encore plus l'apport d'ADN. Les cellules bactériennes doivent être à la phase de croissance mi-exponentielle pour résister au traitement de choc thermique ; dans d'autres stades de croissance, les cellules bactériennes sont trop sensibles à la chaleur, ce qui entraîne une perte de viabilité qui diminue considérablement l'efficacité de la transformation.
Différentes sources d'ADN peuvent être utilisées pour la transformation. Typiquement, les plasmides, petites molécules circulaires d'ADN à double brin, sont utilisés pour la transformation dans la plupart des procédures de laboratoire dans E. coli. Pour que les plasmides soient maintenus dans la cellule bactérienne après la transformation, ils doivent contenir une origine de réplication. Cela leur permet d'être reproduits dans la cellule bactérienne indépendamment du chromosome bactérien. Toutes les cellules bactériennes ne se transforment pas au cours de la procédure de transformation. Ainsi, la transformation donne un mélange de cellules transformées et de cellules non transformées. Pour distinguer entre ces deux populations, une méthode de sélection pour identifier les cellules qui ont acquis le plasmide est utilisée. Les plasmides contiennent habituellement des marqueurs sélectionnables, qui sont des gènes codant un trait qui confère un avantage pour la croissance (c.-à-d. résistance à un antibiotique ou chimique ou sauvetage d'une auotrophie de croissance). Après la transformation, les cellules bactériennes sont plaquées sur des supports sélectifs, ce qui ne permet que la croissance des cellules transformées. Dans le cas des cellules transformées avec un plasmide conférant une résistance à un antibiotique donné, les médias sélectifs seront des supports de croissance contenant cet antibiotique. Plusieurs méthodes différentes peuvent être utilisées pour confirmer que les colonies cultivées dans les milieuis sélectifs sont des transformateurs (c'est-à-dire ont incorporé le plasmide). Par exemple, les plasmides peuvent être récupérés dans ces cellules à l'aide de méthodes de préparation au plasmide (10) et digérés pour confirmer la taille du plasmide. Alternativement, la colonie PCR peut être utilisée pour confirmer la présence du plasmide d'intérêt (11).
L'objectif de cette expérience est de préparer des cellules chimiquement compétentes E. coli DH5MD, en utilisant une adaptation de la procédure de chlorure de calcium (12), et de les transformer avec le plasmide pUC19 pour déterminer l'efficacité de la transformation. La souche E. coli DH5Estest une souche couramment utilisée dans des applications de biologie moléculaire. En raison de son génotype, en particulier le recA1 et endA1, cette souche permet une stabilité accrue de l'insertion et d'améliorer la qualité de l'ADN plasmide dans les préparations ultérieures. Étant donné que l'efficacité de transformation diminue avec l'augmentation de la taille de l'ADN, le plasmide pUC19 a été utilisé dans ce protocole en raison de sa petite taille (2686 bp) (voir https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html pour un carte vectorielle). pUC19 confère une résistance à l'ampicilline et donc, c'était l'antibiotique utilisé pour la sélection.

Bien que l'TE dépende de nombreux facteurs, les préparations cellulaires non commerciales et compétentes, comme celle-ci, donnent normalement de 106 à 107 transformants par microgramme de plasmide. Par conséquent, cette préparation, avec un TE de 2,46 x 108 cfu/g, a donné un TE bien au-delà de la plage prévue. Des protocoles supplémentaires sont disponibles pour fabriquer des cellules supercompétentes lorsque des efficacités de transformation plus élevées ...

Transformation des cellules E. coli en utilisant le chlorure de calcium

Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, and Victor J. DiRita1
1 Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan ...

Les bactéries sont remarquablement adaptables et l’un des mécanismes qui facilite cette adaptation est leur capacité à absorber des molécules d’ADN externes. Un type d’ADN que les bactéries peuvent absorber est appelé plasmide, un morceau d’ADN circulaire qui contient fréquemment des informations utiles, telles que des gènes de résistance aux antibiotiques. Le processus de modification des bactéries par de nouvelles informations génétiques incorporées à partir d’une source externe est appelé transformation. La transformation peut facilement être réalisée en laboratoire à l’aide d’Escherichia coli ou d’E. coli. Pour être transformées, les cellules E. coli doivent d’abord être rendues compétentes, c’est-à-dire capables d’absorber des molécules d’ADN de leur environnement. Le protocole pour y parvenir est étonnamment simple, une courte incubation des cellules dans une solution de chlorure de calcium. Cette incubation rend les cellules perméables aux molécules d’ADN. Une fois que les cellules ont été granulées par centrifugation, le surnageant est éliminé. L’ADN plasmidique est maintenant ajouté aux cellules compétentes. Après avoir incubé les cellules avec de l’ADN, le mélange est brièvement chauffé à 42 degrés Celsius, suivi d’un refroidissement rapide sur de la glace. Ce choc thermique provoque le transfert de l’ADN à travers la paroi et les membranes de la cellule. Les cellules sont ensuite incubées dans un milieu frais. Ensuite, les bactéries sont placées à 37 degrés pour leur permettre de refermer leurs membranes et d’exprimer des protéines résistantes. Les cellules qui ont absorbé les plasmides copieront fidèlement l’ADN et le transmettront à leur descendance et exprimeront toutes les protéines qui pourraient être codées par celui-ci, y compris les médiateurs de résistance aux antibiotiques. Ces gènes de résistance peuvent être utilisés comme marqueurs sélectionnables pour identifier les bactéries qui ont été transformées avec succès parce que les cellules qui n’ont pas absorbé le plasmide n’exprimeront pas le produit du gène de résistance. Cela signifie que lorsque les cellules sont plaquées sur un milieu solide contenant l’antibiotique approprié, seules les cellules qui ont absorbé le plasmide se développeront. La transformation des cellules d’une colonie en croissance peut être confirmée en cultivant ces cellules dans un milieu liquide pendant la nuit afin d’augmenter le rendement avant d’extraire l’ADN de l’échantillon. Une fois l’ADN isolé, une digestion diagnostique de l’enzyme de restriction peut être effectuée. Étant donné que les enzymes de restriction coupent l’ADN à des endroits prévisibles, l’exécution de ces digestions sur un gel devrait montrer un modèle prévisible si le plasmide souhaité a été transformé avec succès. Par exemple, si pUC19 est préparé et coupé avec l’enzyme de restriction HindIII, une seule bande de 2686 nucléotides doit être visible sur le gel. Dans ce laboratoire, vous transformerez la souche DH-5 Alpha d’E. coli avec pUC19, puis confirmerez la transformation réussie par électrophorèse sur gel d’ADN. Avant de commencer l’intervention, enfilez l’équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants. Ensuite, stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 %. Maintenant, préparez des cellules chimiquement compétentes en déposant une boucle pleine de bactéries sur une plaque de gélose LB stérile et en striant les bactéries avec une nouvelle boucle. Ensuite, incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, stérilisez à nouveau la paillasse avec de l’éthanol à 70 % et retirez la plaque de l’incubateur. Inoculez une seule colonie bien isolée dans 3 millilitres de bouillon LB dans un tube avec une boucle stérile. Ensuite, cultivez la culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit, en secouant à 210 tr/min. Le lendemain, mesurez la densité optique de la culture de nuit à l’aide d’un spectrophotomètre. Ensuite, ajoutez 100 millilitres de bouillon LB dans une fiole d’un litre et inocunez-le avec la culture de nuit à une densité optique de 0. 01. Maintenant, incubez la culture à 37 degrés Celsius en secouant et vérifiez l’OD600 toutes les 15 à 20 minutes jusqu’à ce que la culture atteigne une phase de croissance exponentielle moyenne. Après environ trois heures, transférez 50 millilitres de la culture dans deux bouteilles de polypropylène glacées. Ensuite, remettez les bouteilles sur de la glace pendant 20 minutes pour qu’elles refroidissent. Ensuite, récupérez les cellules par centrifugation. Jetez les surnageants et placez les bouteilles à l’envers sur une serviette en papier. Ensuite, remettez en suspension la pastille bactérienne dans cinq millilitres de solution glacée de chlorure de calcium et de chlorure de magnésium et remuez soigneusement jusqu’à ce que la pastille soit complètement dissoute. Ensuite, ajoutez encore 25 millilitres de la solution à la pastille bactérienne dissoute. Remettez en suspension l’autre pastille bactérienne comme démontré précédemment. Après cela, répétez la centrifugation et retirez les surnageants. Si les cellules compétentes doivent être directement transformées, remettez en suspension chaque pastille bactérienne dans deux millilitres d’une solution glacée de chlorure de calcium de 0,1 molaire en remuant les tubes avec précaution. Pour commencer la procédure de transformation, transférez 50 microlitres de cellules compétentes dans deux tubes en polypropylène de 1,5 millilitre marqués. Ensuite, ajoutez un microlitre d’ADN plasmidique pUC19 dans l’un des tubes. Mélangez doucement, en évitant la formation de bulles, et incubez les deux tubes pendant 30 minutes sur de la glace. Après l’incubation, transférez les tubes dans un bloc chauffant et incubez à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes. Transférez immédiatement les tubes dans de la glace et incubez pendant deux minutes. Maintenant, ajoutez 950 microlitres de milieu SOC dans chaque tube et incubez-les pendant une heure à 37 degrés Celsius pour permettre aux bactéries de se rétablir et d’exprimer le marqueur de résistance aux antibiotiques codé dans le plasmide. Pour faire une dilution de 1 à 100, ajoutez 990 microlitres de milieu SOC et 10 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, faites une dilution de 1 à 10 en ajoutant 900 microlitres de milieu SOC et 100 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, placez 100 microlitres de suspensions cellulaires diluées et 100 microlitres de contrôle négatif, sur des plaques sélectives séparées contenant de l’ampicilline à l’aide d’un épandeur et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Après l’incubation, compter les unités formant colonies (UFC) par boîte obtenues par transformation et consigner ces données. Pour vérifier que les transformants ont le plasmide pUC19, prélevez une seule colonie bien isolée dans une plaque avec une boucle stérile et introduisez-la dans un tube contenant 3 millilitres de bouillon LB. Ensuite, incubez la culture à 37 degrés Celsius en secouant, pendant la nuit. Le lendemain, utilisez un mini kit de préparation de l’ADN pour isoler l’ADN de 3 millilitres de la culture, selon les instructions du fabricant. Après avoir terminé la mini-préparation de l’ADN, digérez le 1 microgramme de pUC19 purifié avec une enzyme de restriction à 37 degrés Celsius pendant 1 heure. Maintenant, chargez 20 microlitres d’une échelle de poids moléculaire, 1 microgramme d’ADN plasmidique digéré et 1 microgramme d’ADN plasmidique non digéré dans des puits consécutifs d’un gel d’agarose à 1 % contenant 1 microgramme par millilitre de bromure d’éthidium. Ensuite, faites fonctionner le gel pendant 1 heure à 95 volts. Enfin, visualisez le gel avec un illuminateur UV. Dans cette expérience, des cellules chimiquement compétentes d’E. coli DH5 Alpha ont été préparées à l’aide d’une adaptation de la procédure du chlorure de calcium, puis transformées avec le plasmide pUC19 pour déterminer l’efficacité de la transformation. Pour calculer l’efficacité de la transformation, utilisez les dénombrements d’UFC enregistrés pour les dilutions de 1 sur 100 et de 1 sur 10, ainsi que toute autre dilution dont le nombre d’UFC est compris entre 30 et 300. Tout d’abord, le nombre d’UFC enregistré, 246 dans cet exemple, est divisé par la quantité d’ADN, 0,0001 microgramme ici, qui a été plaquée. Ensuite, ce nombre est divisé par le facteur de dilution utilisé pour donner l’efficacité de transformation en UFC par microgramme. Dans cet exemple, une dilution de 1 à 10 a été utilisée et 100 microlitres d’une solution de 1 millilitre ont été plaqués, ce qui donne un facteur de dilution final de 0,01. Dans la voie plasmidique non digérée, l’ADN circulaire peut apparaître sous la forme de deux ou trois bandes différentes de luminosité variable. En effet, l’ADN circulaire et non coupé peut exister dans plusieurs états de conformation différents, tels que superenroulé, cercle ouvert ou plus linéaire, et chacun d’entre eux se déplace à travers le gel à des vitesses différentes. L’analyse de la digestion de l’ADN plasmidique récupéré a indiqué que le plasmide utilisé a une taille attendue d’ADN pUC19, soit 2 686 paires de bases.

Education

Enseignement

JoVE Science Education

Advanced Biology

Biologie avancée

Microbiology

Microbiologie

calcium chloride dna uptake in e. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency.

Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation. Transformation is the process in which bacteria take up free DNA from the environment. In the lab, it usually includes four steps: preparing competent cells, mixing cells with DNA, recovering the cells, and plating them so transformants can grow.

For transformation to occur, cells must be competent, which means they can take in DNA. Some bacteria become naturally competent under certain conditions. Others do not, or the conditions are not known. For that reason, scientists often make cells artificially competent. Two common approaches are chemical treatment and electroporation, which uses electric pulses to open pores in the cell membrane.

This protocol uses calcium ions, especially Ca2+, to create chemical competence. It is mainly used with Gram-negative bacteria. E. coli cells and their outer membrane carry negative charge, and DNA is also negatively charged. Calcium helps neutralize this repulsion so DNA can attach to the cell surface. The cells and DNA are kept on ice during this step, and then a heat shock at 42°C helps drive DNA into the cells.

The cells must be in mid-exponential growth phase before heat shock. At other growth stages, they are more sensitive to heat and may lose viability. That lowers transformation efficiency. The DNA used for transformation is usually a plasmid, which is a small circular double-stranded DNA molecule. To stay in the cell after transformation, the plasmid must have an origin of replication so it can copy itself independently of the bacterial chromosome.

Not every cell becomes transformed, so the result is a mix of transformed and non-transformed cells. To find the cells that received the plasmid, the procedure uses selection. Plasmids often carry selectable markers, such as antibiotic resistance genes or genes that rescue a growth need. After transformation, the cells are plated on selective media. In this case, the media contains ampicillin, which allows only the transformed cells to grow.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

Cette collection présente les outils clés pour la recherche en microbiologie, y compris le maintien d'un environnement stérile et les techniques d'ensemencement, l'utilisation de milieux sélectifs et l'enrichissement des échantillons, ainsi que les méthodes de culture pour les échantillons mixtes ou purs. Cette collection inclut aussi les méthodes courantes d'identification des isolats microbiens, ainsi que les techniques de manipulation génétique des bactéries.

See how calcium chloride makes E. coli competent for DNA uptake, then use heat shock and ampicillin selection to identify transformants.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli | JoVE K12

Natalia Martin

Andrew J. Van Alst

Rhiannon M. LeVeque

Victor J. DiRita

Department of Microbiology and Molecular Genetics

Michigan State University

Concepts

Performing the Experiment

Results

Genetic Lingo

Overview

An organism is diploid if it inherits two variants, or alleles, of each gene, one from each parent. These two alleles constitute the genotype ...

Punnett Squares

Overview

A Punnett square displays the possible genotypes offspring can inherit from two parental genotypes. If a trait&#x2019;s inheritance pattern ...

Monohybrid Crosses

Overview

In the 1850s and 1860s, Gregor Mendel investigated inheritance by performing monohybrid crosses in pea plants. He crossed two plants that were ...

Dihybrid Crosses

Overview

To determine whether traits are inherited together or separately, Gregor Mendel crossed pea plants that differed in two traits. These parental ...

Law of Segregation

When crossing pea plants, Mendel noticed that one of the parental traits would sometimes disappear in the first generation of offspring, called the F1 ...

Law of Independent Assortment

While Mendel&#x2019;s Law of Segregation states that the two alleles for one gene are separated into different gametes, a different question of how ...

Test Cross

Alleles are different forms of the same gene. Humans and other diploid organisms inherit two alleles of every gene, one from each parent.

An allele is ...

Pedigree Analysis

Overview

A pedigree is a diagram displaying a family&#x2019;s history of a trait. Analyzing pedigrees can reveal (1) whether a trait is dominant or ...

Use Mendel's laws of segregation and independent assortment to analyze patterns of inheritance.

SC.912.L.16.1

Trihybrid Crosses

Trihybrid Crosses
Some of Mendel&#8217;s crosses examined three pairs of contrasting characteristics. Such a cross is called a trihybrid cross. A ...

Chi-square Analysis

The chi-square test is a statistical hypothesis test. It is used to check whether there is a significant difference between an expected value and an ...

Multiple Allele Traits

Incomplete Dominance

Gregor Mendel&#39;s work (1822 - 1884) was primarily focused on pea plants. Through his initial experiments, he determined that every gene in a diploid ...

Lethal Alleles

Agouti: A Lethal Allele
Lucien Cu&#233;not discovered lethal alleles in 1905 while studying the inheritance of coat color in mice. The agouti gene is ...

Polygenic Traits

background-and-environment-affect-phenotype

Background and Environment Affect Phenotype

Although the genetic makeup of an organism plays a major role in determining the phenotype, there are also several environmental factors, such as ...

Discuss observed inheritance patterns caused by various modes of inheritance, including dominant, recessive, codominant, sex-linked, polygenic, and multiple alleles.

SC.912.L.16.2

Base-pairing and DNA Repair

The DNA Replication Fork

Lagging Strand Synthesis

The Replisome

Proofreading

Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template ...

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Replication in Eukaryotes

In eukaryotic cells, DNA replication is highly conserved and tightly regulated. Multiple linear chromosomes must be duplicated with high fidelity before ...

Describe the basic process of DNA replication and how it relates to the transmission and conservation of the genetic information.

SC.912.L.16.3

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

Mutations

Mutations are changes in the sequence of DNA. These changes can occur spontaneously or they can be induced by exposure to environmental factors. Mutations ...

Mutation, Gene Flow, and Genetic Drift

In a population that is not at Hardy-Weinberg equilibrium, the frequency of alleles changes over time. Therefore, any deviations from the five conditions ...

Explain how mutations in the DNA sequence may or may not result in phenotypic change. Explain how mutations in gametes may result in phenotypic changes in offspring.

SC.912.L.16.4

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

RNA Structure

The basic structure of RNA consists of a string of ribonucleotides attached by phosphodiester bonds. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

Types of RNA

Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs perform diverse ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Bacterial RNA Polymerase

Eukaryotic RNA Polymerases

General Transcription Factors

Tissue-specific transcription factors contribute to diverse cellular functions in mammals. For example, the gene for beta globin, a major component of ...

RNA Polymerase II Accessory Proteins

Transcription Elongation Factors

pre-mrna-processing-modification-of-pre-mrna-ends

Pre-mRNA Processing: Modification of pre-mRNA Ends

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Pre-mRNA Processing: RNA Splicing

Transfer RNA Synthesis

Ribosomal RNA Synthesis

The Nucleolus

Additional Subnuclear Structures

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

Improving Translational Accuracy

Nonsense-mediated mRNA Decay

Molecular Chaperones and Protein Folding

The Proteasome

Regulated Protein Degradation

Proteins: From Genes to Degradation

Explain the basic processes of transcription and translation, and how they result in the expression of genes.

SC.912.L.16.5

Chromatin Structure and RNA Splicing

Alternative RNA Splicing

Nuclear Export of mRNA

Discuss the mechanisms for regulation of gene expression in prokaryotes and eukaryotes at transcription and translation level.

SC.912.L.16.6

Molecular Cloning

Molecular cloning is a set of methods, which are used to insert recombinant DNA into a vector - a carrier of DNA molecules that will replicate recombinant ...

An Overview of Genetic Engineering

Genetic engineering &#8211; the process of purposefully altering an organism&#8217;s DNA &#8211; has been used to create powerful research tools and model ...

Recombineering and Gene Targeting

One of the most widely used tools in modern biology is molecular cloning with restriction enzymes, which create compatible ends between DNA fragments that ...

bacterial-transformation-the-heat-shock-method

Bacterial Transformation: The Heat Shock Method

Transformation is the process that occurs when a cell ingests foreign DNA from its surroundings. Transformation can occur in nature in certain types of ...

Bacterial Transformation: Electroporation

The term &#x201C;transformation&#x201D; refers cellular ingestion of foreign DNA.  In nature, transformation can occur in certain types of bacteria.  In ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

Conjugation: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

Source: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases ...

Phage Transduction: A Method to Transfer Ampicillin Resistance from Donor to Recipient E. coli

CRISPR

Bacterial Transformation

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

Bacterial Transformation
ExpandFirst, ensure that each student or student group has a filled ice bucket.
Then, set up a tube rack for each work station.
...

Bacterial Transformation
ExpandIMPORTANT: In addition to wearing the appropriate personal protective equipment, be sure to take care to keep your face ...

Describe how viruses and bacteria transfer genetic material between cells and the role of this process in biotechnology.

A. DNA stores and transmits genetic information. Genes are sets of instructions encoded in the structure of DNA.

B. Genetic information is passed from generation to generation by DNA in all organisms and accounts for similarities in related individuals.

C. Manipulation of DNA in organisms has led to commercial production of biological molecules on a large scale and genetically modified organisms.

D. Reproduction is characteristic of living things and is essential for the survival of species.

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards