7.16
Recombinaison conservatrice spécifique au site et variation de phase
Étant donné que les segments d'ADN sont coupés et réorganisés dans une direction spécifique, la recombinaison spécifique à un site est apparue comme u…
La recombination site-spécifique est un type d'échange génétique où des enzymes spécialisées, appelées recombinases spécifiques de site, catalysent le mouvement des sections d'ADN entre des sites définis qui partagent une certaine homologie de séquence. Lorsque de tels mouvements se produisent, les régions à échanger sont généralement flanquées d'une paire de séquences symétriques composées d'ADN double brin d'environ 20 à 30 paires de base de long. Les enzymes spécialisées, appelées recombinases, qui se lient à ces séquences peuvent appartenir à des familles sérine ou tyrosine recombinase.
Les familles ont un résidu de sérine ou de tyrosine au niveau du site actif de l'enzyme et utilisent des mécanismes distincts. Dans le cas de la sérine recombinase, les sous-unités se lient d'abord spécifiquement à leurs nouvelles séquences de reconnaissance formant un complexe synaptique. Ensuite, la sérine du site actif attaque le phosphodiester de l'ADN au centre de ces séquences, créant ainsi des points d'arrêt connus sous le nom de sites crossover.
Ensuite, les sérine recombinases coupent toutes les hélices d'ADN impliquées avant que l'échange de brin ne se déroule. En revanche, les tyrosine recombinases se lient de la même manière, mais coupent et rejoignent un brin de l'ADN duplex à la fois. Le résidu de tyrosine se lie alors de façon covalente à l'extrémité trois prime du brin clivé, tandis que les groupes hydroxyles libres en cinq prime attaquent la protéine de liaison à l'ADN formant une jonction de Holliday.
Ce modèle complexe est le premier événement d'enjambement. Ensuite, lorsque les brins d'ADN restants sont clivés et échangés par les sous-unités de recombinase dans le second cas, la jonction de Holliday est réparée en produits recombinants. Il existe trois conséquences potentielles de tels événements de recombinaison.
Le premier, est l'intégration dans laquelle une molécule d'ADN circulaire est insérée dans un second ADN linéaire. Lorsque les deux sites sont sur la même molécule d'ADN, le deuxième résultat peut être l'excision, où la partie de l'ADN découpé est simplement retirée, libre de s'intégrer ailleurs dans le génome. Dans le troisième scénario, si les sites d'incision sont dans des orientations opposées, l'inversion peut se produire là où la section d'ADN est retirée, puis réintégrée dans l'orientation opposée.
Un exemple bien étudié de ce phénomène est l'inversion spécifique du site d'un segment chromosomique de la bactérie salmonelle, qui lui permet de produire deux types différents de flageline selon l'environnement. Et ce processus est appelé variation de phase.
Q1: What are site-specific recombinases and how do they recognize DNA?
Site-specific recombinases are specialized enzymes that catalyze genetic exchange at defined DNA sites sharing sequence homology. These enzymes belong to Serine or Tyrosine recombinase families, distinguished by their active site residue. Recombinases bind to symmetric sequences flanking the regions to be exchanged, typically 20 to 30 base-pairs long, forming a synaptic complex before DNA cleavage and strand exchange occur.
Q2: How do Serine and Tyrosine recombinases differ in their mechanisms?
Serine recombinases cut all DNA helices simultaneously before strand exchange, with the active site serine attacking the phosphodiester backbone at crossover sites. Tyrosine recombinases cut and join one DNA strand at a time, with the tyrosine residue covalently bonding to the 3' end of the cleaved strand. This creates a Holliday junction intermediate, which is resolved during the second crossover event to produce recombinant products.
Q3: What are the three main outcomes of site-specific recombination events?
Integration occurs when circular DNA inserts into linear DNA. Excision happens when both sites are on the same molecule, removing a DNA section for integration elsewhere. Inversion results when incision sites are in opposite orientations, causing the DNA section to be removed and reintegrated in reverse orientation, as seen in Salmonella phase variation.
Q4: What is phase variation and how does it relate to site-specific recombination?
Phase variation is a site-specific inversion process in Salmonella where a chromosomal segment inverts to produce two different flagellin protein types depending on environmental conditions. The inversion mechanism relies on site-specific recombination, allowing the bacterium to switch between flagellin variants by reversing the DNA orientation, enabling immune evasion and environmental adaptation.
Q5: How are Cre and Flp recombinases used in genetic engineering?
Cre and Flp are tyrosine recombinases derived from bacteriophages used to mediate site-specific DNA insertions, deletions, and targeted protein expression in mammalian cells. Cre recognizes LoxP sites, which are 34 base-pairs long containing 13 bp palindromic sequences. Tissue-specific and ligand-inducible promoters provide spatial and temporal control over recombinase activity for precise genome editing.
Q6: What is the main limitation of using site-specific recombination for genome editing?
The primary limitation is that recombination target sites must be pre-inserted or present naturally in the genome. Recent advances using mutagenesis and gene shuffling have designed Flp variants recognizing sites with combinatorial mutations, offering promise for creating more specific recombinase variants for commercial genome engineering applications.
Q7: Why is site-specific recombination effective as a genetic engineering technique?
Site-specific recombination is efficient because DNA segments are cut and reorganized in a direction-specific manner, providing precise control over genetic modifications. This specificity enables targeted insertions, deletions, and inversions without random integration. The ability to use engineered recombinases with tissue-specific or inducible promoters allows researchers to control when and where recombination occurs in living organisms.