Séquençage de Sanger

Pour certaines expériences ou certains diagnostics, il peut être nécessaire d’obtenir la séquence nucléotidique de l’ensemble du génome d’un organisme pour mieux comprendre les gènes ou les allèles présents, leur fonction et les maladies associées. Cela peut être réalisé en utilisant le séquençage de l’ADN.

Deux techniques traditionnelles de séquençage de l’ADN bien connues sont la méthode de séquençage de Sanger et la méthode Maxam-Gilbert.

Dans le séquençage de Sanger - également connu sous le nom de terminaison de chaîne ou séquençage didésoxynucléotidique - l’ADN matrice pur à séquencer est amplifié par PCR en présence d’amorces appropriées, de dNTP et de bases modifiées, appelées didésoxynucléotides ou ddNTP.

Les didésoxynucléotides n’ont pas le groupe hydroxyle des désoxynucléotides, ce qui limite leur capacité à former des liaisons phosphodiester avec les nucléotides adjacents.

Chaque didésoxynucléotide est également marqué avec un marqueur fluorescent différent pour faciliter sa détection.

La première étape consiste à dénaturer l’ADN matrice en un ADN simple brin.

Ensuite, au fur et à mesure que les amorces se lient à la région d’intérêt, l’ADN polymérase commence à ajouter de nouveaux nucléotides au brin d’ADN et incorpore parfois un didésoxynucléotide au lieu d’un désoxynucléotide - ce qui termine l’amplification de l’ADN.

Le résultat est des fragments d’ADN de longueurs variables, chacun se terminant par un didésoxynucléotide marqué.

Ces fragments d’ADN sont ensuite analysés sur un gel capillaire pour les séparer en fonction de leur taille, et les spectres d’émission de chacun de ces fragments sont analysés par un logiciel automatisé pour déchiffrer la séquence génétique de l’ADN souhaité.