Séquençage de nouvelle génération

Le séquençage de nouvelle génération est le nom collectif d’un groupe de technologies qui peuvent faciliter la génération relativement rapide de données de séquençage à partir de nombreuses espèces différentes ou de groupes d’individus.

Ces données peuvent être utilisées pour la génétique des populations à petite échelle ou les études cliniques, et ces technologies sont plus rapides et plus rentables que les méthodes de séquençage traditionnelles.

Il existe de nombreuses méthodes de séquençage de nouvelle génération, mais la plus populaire est sans doute le séquençage réversible à terminateur. D’autres incluent le pyroséquençage et le séquençage par ligature.

Dans le séquençage terminateur réversible, l’ADN génomique pur est d’abord coupé en fragments plus petits de 100 à 1000 paires de bases. Des adaptateurs spéciaux, qui sont des séquences d’oligonucléotides avec des sites d’amorce, sont ensuite ligaturés aux deux extrémités de ces fragments d’ADN.

Les fragments d’ADN simple brin sont ensuite chargés sur une puce spécialisée appelée cellule d’écoulement qui est pré-recouverte de courtes séquences d’oligonucléotides complémentaires aux séquences adaptatrices. Les fragments d’ADN se lient à la puce par l’intermédiaire de leurs adaptateurs.

Dans l’étape d’amplification, l’ADN polymérase est ensuite utilisée pour synthétiser un brin d’ADN complémentaire. L’ADN double brin est dénaturé et le modèle d’origine est lavé.

Le brin complémentaire restant se plie ensuite et forme une structure en forme de pont à l’aide du deuxième adaptateur à l’autre extrémité.

L’ADN polymérase peut ensuite synthétiser un brin complémentaire du brin d’ADN courbé - un processus appelé amplification en pont.

Le pont double brin est à nouveau dénaturé pour générer de l’ADN linéaire simple brin, qui peut ensuite former de nouveaux ponts sur la puce.

L’ADN polymérase poursuit ces cycles d’amplifications en pont, synthétisant des milliers de copies d’un fragment d’ADN et aboutissant à la génération de grappes clonales.

Tous les brins complémentaires inverses sont ensuite lavés de la puce, ne laissant que les brins d’ADN directs immobilisés sur la puce.

La réaction de séquençage commence par l’ajout d’ADN polymérase avec des dNTP modifiés marqués de quatre marqueurs fluorescents différents. Ces dNTP contiennent également une fraction bloquante de 3', appelée terminaison réversible, qui ne permet l’ajout que d’un seul dNTP à la fois.

Après chaque série d’ajout de dNTP au brin en croissance, la puce est imagée et la longueur d’onde d’émission de chaque groupe d’ADN est utilisée pour identifier la base.

La séquence d’images de fluorescence de la cellule d’écoulement capturée après chaque ajout de dNTP est utilisée pour déterminer la séquence des fragments d’ADN.