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Profilage des ribosomes
Le profilage des ribosomes ou ribo-séquençage est une technique de séquençage en profondeur qui produit un instantané de la traduction active dans une…
L’identification des régions d’un génome qui sont transcrites et traduites en protéines est une étape essentielle dans la compréhension d’un génome et de son expression.
Ceci est réalisé à l’aide d’une technique appelée profilage des ribosomes, également appelée ribo-seq. Il cartographie les positions des ribosomes sur l’ARNm et identifie les ARNm qui sont activement traduits en protéines.
Pour isoler l’ARN, les cellules doivent d’abord être lysées pour accéder aux molécules qu’elles contiennent. Le lysat est ensuite traité avec des RNases. Ces enzymes clivent les ARNm qui ne sont pas recouverts de ribosomes, ne laissant que les fragments d’ARNm protégés.
Les fragments protégés par le ribosome sont ensuite séparés des fragments non protégés et clivés à l’aide d’un gradient de saccharose.
Les ribosomes sont ensuite retirés des fragments d’ARNm, et l’ARN est converti en ADN par RT-PCR, en utilisant l’enzyme transcriptase inverse.
Ensuite, l’ADN est séquencé et cartographié sur le génome de référence. Cela détermine l’emplacement exact du ribosome le long de chaque ARNm.
Le profilage des ribosomes peut également aider à identifier les cadres de lecture ouverts ou ORF non reconnus. Un ORF est une région de l’ADN située entre un codon de départ et un codon d’arrêt qui peut être traduite en protéine. La découverte d’ORF peut être utile à l’identification de nouveaux gènes.
Prenons l’étude des modèles d’expression génique dans une lignée cellulaire de mammifère. La procédure expérimentale consiste à exposer les cellules à des stimuli qui peuvent activer l’expression des gènes et initier la synthèse de l’ARNm.
Les ARNm qui sont activement traduits sont identifiés à l’aide du profilage des ribosomes.
Cette expérience révèle que le gène B est traduit alors que les gènes A et C ne le sont pas.
Il montre également qu’une petite région supplémentaire du génome, d’une centaine de nucléotides de long, est activement traduite.
Cette région non reconnue est un cadre de lecture ouvert qui peut coder pour une nouvelle protéine qui est régulée à la hausse par les stimuli expérimentaux.
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Q1: What is ribosome profiling and what does it measure?
Ribosome profiling, also called ribo-seq, is a deep sequencing technique that maps ribosome positions on mRNA to identify actively translated genes. It produces a snapshot of the translation landscape in a cell at any given moment by selectively sequencing mRNAs protected by ribosomes, revealing which genes are being translated into proteins.
Q2: How does ribosome profiling isolate and protect mRNA fragments?
Cells are lysed to access internal molecules, then the lysate is treated with RNases that cleave unprotected mRNAs. Ribosomes shield their bound mRNA from cleavage, leaving only ribosome-protected fragments. These protected fragments are then separated from cleaved fragments using a sucrose gradient for further analysis.
Q3: What role do open reading frames play in ribosome profiling analysis?
Ribosome profiling identifies open reading frames (ORFs), which are DNA regions between start and stop codons that can be translated into proteins. Discovering unrecognized ORFs helps identify new genes and novel proteins. In experimental studies, ribosome profiling can reveal previously unknown translated regions upregulated by specific cellular stimuli.
Q4: How is ribosomal RNA contamination addressed in ribosome profiling?
Ribosomal RNA (rRNA) that binds to mRNA is typically removed during ribosome profiling. However, rRNA contaminants sometimes persist. Researchers use the duplex-specific nuclease (DSN) enzyme, isolated from the Kamchatka crab hepatopancreas, which cleaves dsDNA and DNA-RNA hybrids to reduce rRNA contamination in samples.
Q5: What technical challenges does ribosome profiling face?
Ribosome profiling requires large sample amounts, timely translation inhibition, and managing RNA contamination. Flash-freezing efficiently captures ribosome distribution compared to elongation inhibitors like cycloheximide. Data analysis also demands bioinformatics expertise; the riboSeqR R package helps overcome this limitation by providing methods for resolving profiling data across multiple samples.
Q6: How does ribosome profiling convert mRNA to DNA for sequencing?
After ribosomes are removed from protected mRNA fragments, the RNA is converted into DNA using reverse transcriptase through RT-PCR. The resulting DNA is then sequenced and mapped onto a reference genome to determine the exact ribosome location along each mRNA molecule.
Q7: What applications does ribosome profiling have in studying gene expression?
Ribosome profiling enables in vivo monitoring of translation in specific organs or tissues and quantifies new protein synthesis levels. It discovers translated products including short peptides and protein isoforms with unknown functions. The technique also identifies mRNAs that remain untranslated until receiving external signals, revealing dynamic translation regulation.