33.4: Microscopie d’immunofluorescence

Un microscope à fluorescence utilise des chromophores fluorescents appelés fluorochromes, qui peuvent absorber l’énergie d’une source lumineuse, puis émettre cette énergie sous forme de lumière visible. Les fluorochromes comprennent des substances naturellement fluorescentes (telles que les chlorophylles) et des colorants fluorescents qui sont ajoutés à l’échantillon pour créer un contraste. Des colorants tels que le rouge Texas et le FITC sont des exemples de fluorochromes. D’autres exemples incluent les colorants d’acide nucléique 4′,6′-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et l’orange acridine.

Le microscope irradie l’échantillon avec une excitation de courte longueur d’onde, telle que l’ultraviolet ou la lumière bleue. Les chromophores absorbent la lumière d’excitation et émettent de la lumière visible de plus grandes longueurs d’onde. La lumière d’excitation est ensuite filtrée (en partie parce que la lumière ultraviolette est nocive pour les yeux) de sorte que seule la lumière visible passe à travers le cristallin oculaire, produisant une image de l’échantillon dans des couleurs vives sur un fond sombre.

Les microscopes à fluorescence peuvent identifier des agents pathogènes, trouver des espèces particulières dans un environnement ou trouver l’emplacement de molécules et de structures particulières dans une cellule. Des approches ont également été développées pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes selon qu’elles absorbent ou non des fluorochromes particuliers. Parfois, plusieurs fluorochromes sont utilisés sur le même échantillon pour montrer des structures ou des caractéristiques différentes.

L’une des applications les plus importantes de la microscopie à fluorescence est l’immunofluorescence, qui est utilisée pour identifier certains microbes en observant si des anticorps se lient à eux. (Les anticorps sont des molécules protéiques produites par le système immunitaire qui se fixent à des agents pathogènes spécifiques pour les tuer ou les inhiber.) Cette technique comporte deux approches : le dosage par immunofluorescence directe (DFA) et le dosage par immunofluorescence indirecte (IFA). Dans l’AFD, des anticorps spécifiques (par exemple, ceux qui ciblent le virus de la rage) sont colorés avec un fluorochrome. Si l’échantillon contient l’agent pathogène ciblé, on peut observer les anticorps qui se lient à l’agent pathogène au microscope fluorescent. Il s’agit d’une coloration primaire des anticorps car les anticorps colorés se fixent directement à l’agent pathogène.

Dans l’IFA, les anticorps secondaires sont colorés avec un fluorochrome plutôt qu’avec des anticorps primaires. Les anticorps secondaires ne se fixent pas directement à l’organisme mais se lient aux anticorps primaires. Lorsque les anticorps primaires non colorés se lient à l’agent pathogène, on peut observer que les anticorps secondaires fluorescents se lient aux anticorps primaires. Ainsi, les anticorps secondaires sont attachés indirectement à l’agent pathogène. Étant donné que plusieurs anticorps secondaires peuvent souvent se fixer à un anticorps primaire, l’IFA augmente le nombre d’anticorps fluorescents attachés à l’échantillon, ce qui facilite la visualisation de ses caractéristiques.