Préparation des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentleMACS

Résumé

Cette vidéo décrit un simple gain de temps technique pour la dissociation des tissus automatisée en utilisant les dissociateur gentleMACS pour préparer une seule cellule de suspensions de splénocytes de souris.

Résumé

Une seule cellule suspensions sont un préalable pour des expériences dans la séparation des cellules, l'analyse cellulaire et culture cellulaire. Pour éviter de dissociations manuel fastidieux et souvent douloureux de la dissociateur gentleMACS permet de dissocier les tissus de manière très efficace dans des conditions contrôlées et reproductibles. Le dissociateur gentleMACS peut dissocier de manière optimale la rate de souris, combinant un gain de temps et de normalisation par l'utilisateur de sécurité. Cette vidéo décrit comment dissocier les rates de souris en utilisant le dissociateur gentleMACS, un système automatisé de paillasse dispositif qui peut perturber la mécanique des tissus en utilisant des tubes spéciaux pour produire des suspensions de cellules viables. Suite à la dissociation, les rates sont filtré, centrifugé et resuspendu pour d'autres applications.

Protocole

Introduction à l'équipement

1. Le tissu est légèrement dissocié, en utilisant le violet Tubes C dans viables unicellulaires suspensions.
2. Le tampon PBS / BSA EDTA est utilisé pour dissocier les cellules. Le tampon est préparé en ajoutant une partie de la solution stock de BSA à 20 parties de solution de rinçage autoMACS contenant de l'EDTA.
3. Le MACS Pré-Séparation filtres sont utilisés pour que les échantillons de tissus dissociés sont libres de tous les amas cellulaires, la promotion réussie de séparation MACS et l'analyse subséquente.

Dissocier les cellules de la rate

1. Rate entiers sont disscociated dans une seule cellule de suspensions de splénocytes utilisant le dissociateur gentleMACS.
2. Pour commencer la procédure, la charge du tube C avec un volume de tampon en fonction de la masse de la rate. Une rate saine d'un adulte jeune femelle souris BALB / c pèse environ 80-120 mg. Aux 1 à 2 rates de cette masse besoin de 3 mL de tampon. Rates provenant d'animaux âgés ou des animaux atteints d'infections sont souvent plus grandes et doit être pesé dans la mémoire tampon. Les volumes de tampon doit être modulée en conséquence. Ne pas dépasser un volume tampon total de 10 ml.
3. Ajouter la rate disséqués pour le tube C contenant 3 ml de tampon.
4. Assurez-vous que le bouchon du tube C est serré et fixer le tube C de la dissociateur avec le bouchon vers le bas.
5. Mettez le dissociateur. Pour 1-2 rate, sélectionnez m_spleen_01 programme. Le programme va prendre 56 secondes pour terminer. Si le nombre des rates est supérieure, l'utilisation du programme m_spleen_04, ce programme peut être utilisé pour un maximum de 720 mg de tissu splénique.
6. Après l'achèvement du programme du tissu splénique natif est dissocié en une suspension de splénocytes.
7. Isoler la suspension de cellules entières au 300xg à température ambiante pendant environ 30 secondes. Cela garantira que le rotor et le stator sont libérés de toutes les cellules qui sont recueillis au fond du tube C.
8. Retirer l'échantillon à travers le septum étanche ouverture dans le capuchon du tube C en utilisant un pipetteur 1000 microlitre.

Étape de filtration

1. Pour commencer l'étape de filtration, appliquer le tissu dissocié de la pré-filtre de séparation ou une passoire cellule avec 30 um de taille des pores. Le tamis doit s'adapter à un tube de 15 ml pendant 1-2 rate ou un tube de 50 ml pendant plus de 2 rates.
2. Laissez la suspension cellulaire passer à travers. Puis laver le filtre en appliquant 5 ml de tampon.
3. Maintenant, centrifuger le tube avec la suspension cellulaire à 300xg, à température ambiante pendant 10 minutes pour recueillir toutes les splénocytes dans une cellule de la rate à granulés.
4. Maintenant, que nous avons une pastille de splénocytes dissociés, nous devons aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans une quantité appropriée de mémoire tampon.

La dissociation rate utilisant le dissociateur gentleMACS donnera un pourcentage élevé de splénocytes viable, ce qui est démontré par cytométrie en flux à l'aide de l'analyseur MACSQuant. Les cellules mortes sont colorées par de l'iodure de propidium. Dans l'exemple fourni, l'intrigue avant du côté de dispersion point indique les splénocytes préparé.

Discussion

Pour éviter de dissociations manuel fastidieux et souvent douloureux, le dissociateur gentleMACS permet de dissocier les tissus de manière très efficace dans des conditions contrôlées et reproductibles. La procédure de dissociation des tissus est doux pour les cellules et les suspensions rendements cellulaires avec un taux de viabilité élevés. Le dissociateur gentleMACS en combinaison avec le C Tubes est conçu pour la préparation des suspensions unicellulaires à partir de différents tissus. L'instrument est équipé d'un certain nombre de programmes préréglés pour dissocier la rate de souris, le foie, les poumons ou les tissus nerveux. L'éventail des programmes et des protocoles sera continuellement élargi pour inclure d'autres tissus.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit de démarrage gentleMACS™	Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
Tubes de 13 mL	Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
Solution de rinçage autoMACS™	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
Solution mère de BSA MACS®	Miltenyi Biotec	130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Filtres de pré-séparation	Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
Analyseur MACSQuant	Miltenyi Biotec	130-092-197
Solution d'iodure de propidium	Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx