Traditionnellement, la tranche verticale et de toute la préparation de montage de la rétine ont été utilisés pour étudier la fonction des circuits de la rétine. Ici, nous décrivons le roman tranchage méthode pour préserver la morphologie dendritique des neurones rétiniens intacte.
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Article de méthode
Préparation tranche horizontale de la rétine
Dans cet article
Résumé
Résumé
Traditionnellement, la tranche verticale et de toute la préparation de montage de la rétine ont été utilisés pour étudier la fonction des circuits de la rétine. Cependant, de nombreux neurones de la rétine, telles que les cellules amacrines, d'élargir leurs dendrites horizontalement, de sorte que la morphologie des cellules est censée être gravement endommagés dans les tranches verticales. Dans toute la préparation de montage, notamment pour les enregistrements de patch-clamp, les neurones rétiniens dans la couche intermédiaire ne sont pas facilement accessibles en raison de l'importante couverture des cellules gliales endfeets s (cellule de Mueller). Ici, nous décrivons le roman tranchage méthode pour préserver la morphologie dendritique des neurones rétiniens intacte. La tranche a été faite à l'horizontale à la couche interne de la rétine à l'aide d'une trancheuse vibratome après la rétine a été intégré dans le bas température de fusion gel d'agarose. Dans cette préparation tranche horizontale de la rétine, nous avons étudié la fonction des neurones de la rétine par rapport à leur morphologie, en utilisant patch-clamp, la technique d'imagerie calcique, immunocytochimie, et une seule cellule de RT-PCR.
Protocole
- Préparer un bloc de gélose (30 mg / ml, soit 3%, dans l'eau distillée). Dissoudre et micro-ondes c'est d'abord et versez-la dans un plat en verre. Gardez le plat au réfrigérateur à 4 o C.
Astuce: Le bloc de gélose doivent être préparés à l'avance.
- Préparer à basse température de fusion du gel d'agarose (25 mg / ml, soit 2,5%, en moyenne). Dissoudre et micro-ondes qu'elle. Gardez-le dans le bain d'eau chaude à 35 ° C.
Astuce: Conserver le gel d'agarose pas trop chaud. Si elle est trop chaude, elle prend beaucoup de temps pour être solidifié, et le gel peut tuer la rétine
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Discussion
Il ya plusieurs avantages importants de la préparation tranche horizontale de la rétine.
Tout d'abord, la morphologie des cellules qui s'étendent horizontalement dendrites, comme les cellules amacrines et les cellules horizontales, est préservée. Il a été démontré qu'il ya plus de 20 types de cellules amacrines dans la rétine (MacNeil et Masland, 1998), de sorte qu'il est très important de comparer la morphologie des cellules avec la propriété physiologique.
Deuxièmement, dans la rétine toute monture, la couv.......
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Déclarations de divulgation
Tous les protocoles expérimentaux ont été menés conformément aux National Institutes of Health des lignes directrices pour l'utilisation des animaux.
Remerciements
Nous remercions les Drs. Richard H. Masland et Akimichi Kaneko de nous donner des conseils et des suggestions utiles pour établir la procédure de la préparation de tranches horizontales de la rétine.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Agarose à bas point de fusion |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Milieu | en mM : 102 NaCl, 3,1 KCl, 2,0 CaCl2, 1,0 MgCl2, 23 NaHCO3, et 10 glucose, maintenu à pH 7,8, ou solution d'Ames’ (Sigma) | ||
| Micro-ondes | |||
| Bain-marie | 35 °C | ||
| Trancheur vibratome | Leica Microsystems | VT1000S | |
| Filtres à membrane MF | EMD Millipore | HAWP01300 | Papier filtre, taille de pore 0,45 µm |
| Matériel de dissection | pinces, lame, pince, tweezers, etc. | ||
| Colle instantanée | par ex. Alonalpha, Krazy Glue | ||
| Seringue de 50 mL | |||
| Filtre pour seringue | EMD Millipore | SX0001300 |
Références
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H.
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Réimpressions et autorisations
