Drosophile larvaire JNM Dissection

Résumé

Ce protocole démontre comment disséquer Drosophile en préparation pour l'immunohistochimie et / ou l'imagerie de la jonction neuromusculaire.

Protocole

Avant de commencer

1. Toutes les cultures doivent être cultivées à 25 ° C.
2. HL3.1 tampon dissection peut être préparé à l'avance. Prenez une aliquote de 50 ml de HL3.1 et le garder sur la glace.
3. Préparer 15 ml de formaldéhyde 3,5% frais dans HL3.1. Gardez-le sur la glace.

Dissection des larves

1. Mettre une goutte de HL3.1 froid sur le plateau de dissection. Cela permet de garder l'animal de se dessécher et de l'étourdissement rend plus facile à travailler.
2. Utilisation de la pince à long, sélectionnez une errance troisième stade larvaire et le placer dans la goutte de HL3.1.
3. Tout d'abord, l'utilisation de pinces pour saisir courte une épingle minutien. Placez la broche entre les stigmates postérieurs. L'animal sera généralement tenter de s'éloigner en rampant de la broche qui s'allongea et de le rendre plus facile pour vous de placer une épingle carrément dans la tête de la larve à proximité de la crochets bouche. Étirez l'animal hors de la longueur. Cela vous aidera à maximiser la quantité de paroi du corps exposées que vous pouvez réaliser pendant la coupe. Remarque: Si vous choisissez à la broche de la tête la première, l'animal peut envelopper son corps autour de l'axe ou le fouet de son corps d'avant en arrière ce qui rend difficile à cerner. Vous pouvez habituellement contrer cela en supprimant le HL3.1 et mettre une goutte douce froide étonnante de l'animal à nouveau. Le scientifique ambidextres pouvez aussi attraper l'animal et le maintenir en place.
4. Des ciseaux à ressort aide faire une incision horizontale juste en avant à la broche postérieure sur la face dorsale de la larve. Placer une lame des ciseaux dans l'incision et faire une coupe verticale le long de la ligne médiane dorsale vers la fin rostrale de la larve. A la tribune de l'animal faire des incisions horizontales à gauche et à droite de l'épingle. Remarque: le résultat final devrait ressembler à un I sur la face dorsale de la larve dans l'axe rostrocaudal.
5. Enlever les organes. Commencez par mettre quelques gouttes supplémentaires de HL3.1 sur la larve. Cela permettra aux organes de flotter jusqu'à l'extérieur du corps vous permettant de les retirer plus facilement. D'abord, enlever le système trachéal. Deuxièmement, l'utilisation de la pince pour saisir le reste des organes et de les supprimer.
6. Lors de l'étape 3, vous faites un rabat à gauche et volet droit de la paroi du corps. Epingler les rabats dans un sens horaire en veillant à étirer la paroi du corps à la fois horizontalement et verticalement.

Fixation

Fixer chaque animal dans du formol 3,5% en HL3.1 pendant 25 minutes. Laver l'animal à deux reprises en HL3.1 pendant 5 minutes.

Stockage

Retirez les broches et le transfert des larves dans un tube de 1,5 ml contenant du PBS 1X. Si vous prévoyez d'utiliser l'image de la JNM fusionné étiquettes fluorescentes, vous devriez l'image des animaux dans les deux jours. Vous pouvez stocker les larves disséquées pour une semaine au maximum à 4 ° C.

Les résultats représentatifs

Il ya plusieurs éléments clés pour une larve de drosophile bien disséqué. D'abord, il faut prendre des précautions supplémentaires pour ne pas endommager les muscles, surtout les muscles 4, 6 et 7. Ce sont les muscles les plus populaires pour étudier et, si elles sont endommagées jeter le filet de préparation et de disséquer un autre animal. Deuxièmement, on doit s'assurer que l'animal est au maximum étirée de sorte que chaque muscle et JNM peuvent être distinguées.

Discussion

La technique de dissection démontré dans cette vidéo peut être utilisée pour préparer des larves de drosophile pour une variété de techniques expérimentales. Si les balises protéine fluorescente sont présents, les larves peuvent être montés et imagé immédiatement. Sinon, immunomarquage peuvent être effectuées afin de marquer spécifiques compartiments synaptiques. En outre, l'électrophysiologie peut facilement être effectuée sur des larves disséquées afin d'évaluer le fonctionnement de la neurotransmissi...

Matériaux

HL3 Tampon Dissection: (en mm) 70 NaCl, KCl 5, 0,2 CaCl2, MgCl2 20, 10 NaHCO3, 5 tréhalose, le saccharose 115, et 5 HEPES, pH 7,3.
Sylgard Plate Dissection: Mélanger doucement (pour éviter les bulles) 10h01 dans un bécher. Versez la préparation dans une boîte de Petri (toutes tailles). Autoriser Sylgard pour guérir la nuit dans 37C incubateur.