Mutagenèse dirigée maison des plasmides entiers

Résumé

Mutagenèse dirigée de plasmides ensemble est un moyen simple de créer des variations légèrement différentes d'un plasmide d'origine. Ici nous démontrons une manière facile et rentable d'introduire des substitutions de bases dans un plasmide standard en utilisant des réactifs.

Résumé

Mutagenèse dirigée de plasmides ensemble est un moyen simple de créer des variations légèrement différentes d'un plasmide d'origine. Avec cette méthode, le gène cible clonés peuvent être modifiés par substitution, délétion ou d'insertion de quelques bases directement dans un plasmide. Il fonctionne tout simplement en amplifiant le plasmide entier, dans une réaction thermocyclage PCR non. Lors de la réaction amorces mutagènes, porteurs de la mutation souhaitée, sont intégrés dans le plasmide nouvellement synthétisé. Dans ce tutoriel vidéo, nous démontrons une manière facile et rentable d'introduire des substitutions de bases dans un plasmide. Le protocole fonctionne avec des réactifs standard et est indépendant de kits commerciaux, qui sont souvent très coûteux. L'application de ce protocole peut réduire le coût total d'une réaction à un huitième de ce qu'il en coûte en utilisant certains des kits commerciaux. Dans cette vidéo, nous avons également des commentaires sur les étapes essentielles du processus et donner des instructions détaillées sur la façon de concevoir les amorces mutagènes.

Protocole

Principe de la méthode:

La mutagenèse dirigée de plasmides entière expliqué dans cette vidéo est une méthode de mutagenèse qui vous permet de modifier un gène cible clonée par substitution, délétion ou d'insertion de quelques bases directement dans un plasmide. Il agit en amplifiant le plasmide entier, dans une réaction thermocyclage PCR non. Lors de la réaction amorces mutagènes, portant la mutation désirée sous forme d'inadéquation au plasmide d'origine, sont intégrés dans le plasmide nouvellement synthétisé. Après l'élimination du plasmide d'origine de la réaction du plasmide muté est transformé en E. coli. L....

Discussion

Mutagenèse dirigée est une méthode qui mutagenèse fournit un moyen rapide de muter un gène porté par un plasmide. La réaction peut être fait tout en une seule journée. Avec cette méthode, il suffit d'une paire d'amorces complémentaires portant les mutations souhaitées et une polymérase Pfu relecture tels que-polymérase. Le plasmide nouvellement synthétisés peuvent être séparés du plasmide parental en digérant la réaction avec l'enzyme de restriction Dpnl. Cette enzyme digère l'ADN méthylé uniquement. Par.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Polymerase Pfu (recombinante ou native)	Fermentas	EP0571 or EP0501
Mélange de dNTP à 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI ou DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
Amorces	Invitrogen		désalinisées