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Article de méthode

Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 3

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DOI :

10.3791/1170

⸱

13 avril 2009

 ,  , 
1Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology

Dans cet article

Résumé

Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux. Partie 3 décrit le processus d'étiquetage de l'ARN par fluorescence amplifié à partir de l'hôte et des échantillons viraux par le couplage d'allyle aminés de colorants.

Résumé

La famille

Protocole

Partie 1: ARNa étiquetage: couplage allyliques aminés des colorants

  1. Ajouter 1 pg des échantillons dans des tubes à centrifuger ARNa 1.5ml.
  2. Vide sécher les échantillons à feu doux jusqu'à ce qu'ils ou pas sont complètement secs. Cap chaque tube dès qu'il est sec - ne pas trop sécher!
  3. Ajouter 9μl tampon de couplage à chaque tube et remettre les ARNa par un léger vortex pendant 1 minute. Centrifuger brièvement pour prélever l'échantillon dans le fond du tube, puis laisser l'échantillon reposer sur la glace.
  4. Ajouter 22μl de DMSO de haute qualité pour chaque tube de Cy3 ou Cy5 colorant. Un tube de colorant est suffisant pour deux échantillons. Le colorant Cy3 est pour l'étiquetage de vos échantillons de référence, et le colorant Cy5 est pour l'étiquetage de vos échantillons.
  5. Vortex les colorants pour bien mélanger. Gardez les colorants dans l'obscurité jusqu'au moment de servir. Ne pas préparer de teinture plus tôt que 1 heure avant utilisation. Assurez-eau ne pénètre pas dans le mélange colorant / DMSO à tout moment.
  6. Ajouter 11μl de DMSO préparées / Cy colorant pour chaque échantillon. Mélangez bien en vortexant doucement.
  7. Incuber pendant 30-45 minutes à température ambiante. Couvrir les échantillons de papier d'aluminium ou de les garder dans un tiroir pour minimiser l'exposition à la lumière.
  8. Après l'incubation, ajouter 4.5μl hydroxlyamine à chaque échantillon pour stopper la réaction. Mélangez bien en vortexant doucement.
  9. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Couvrir les échantillons de papier d'aluminium ou de les garder dans un tiroir pour minimiser l'exposition à la lumière.

Partie 2: Labeled ARNa nettoyage

  1. Vortex les perles liaison à l'ARN brièvement pour obtenir un mélange homogène avant utilisation.
  2. Préparer le ARNa Mix reliure à température ambiante. (Tableau 1)
  3. Mélangez bien au vortex.
  4. Aliquoter le tampon d'élution ARNa dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes.
  5. Ajouter 70μl de l'ARNa mélange de liant à chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois.
  6. Transférer les échantillons de la plaque PCR de 96 puits à fond rond assiette.
  7. Ajouter 50 pl de 100% d'isopropanol à chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois.
  8. Secouez doucement la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes pour bien mélanger les échantillons.
  9. Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand jusqu'à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés.
  10. Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. Le surnageant doit être soit un rose vif ou d'un bleu vif à ce point à cause de molécules de colorant non constituées en société.
  11. Retirer la plaque du socle magnétique.
  12. Ajouter 100 ul Solution Laver ARNa dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l'agitateur orbital à vitesse modérée. Perles peut pas entièrement se dispersent à cette étape.
  13. Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques.
  14. Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant.
  15. Retirer la plaque du socle magnétique.
  16. Répétez le laver une fois 2 ème avec 100 ul Solution Laver ARNa.
  17. Après le lavage 2 ème, sécher les perles en secouant la plaque pendant 1 minute sur l'agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher les échantillons!
  18. Eluer la ARNa des billes en ajoutant 20 pi de tampon d'élution préchauffé ARNa à chaque échantillon.
  19. Secouez vigoureusement la plaque sur l'agitateur orbital pendant 3 minutes, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant.
  20. Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d'un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Le surnageant contient les nettoyer, les échantillons ARNa étiquetés, et devrait être soit un rose pâle ou bleu pâle.
  21. Soigneusement transférer le ARNa élué à une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR).
  22. (Étape facultative) Vérifiez la concentration en ARN et la quantité de colorant dans les échantillons en mesurant 1.5μl sur un spectrophotomètre NanoDrop utilisant le module biopuces.
  23. Immédiatement hybrider les ARNa étiquetés sur une plateforme biopuces de votre choix, ou, alternativement, vous pouvez stocker les ARNa étiquetés à -80 ° C jusqu'à ce que vous êtes prêt pour l'hybridation.

Tableau 1 ARNa Mix reliure

Réactifs Montant pour une réaction
Perles liaison à l'ARN * 10 ul
* Remise en suspension de billes Solution 4μl
100% d'isopropanol ** 6μl
Concentré ARNa Binding Buffer 50 pl

* Mélanger les perles de liaison avec l'ARNsolution de billes resuspension premier
** Ajouter l'isopropanol et bien mélanger avant d'ajouter le concentré de tampon de liaison ARNa.

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Discussion

Étapes critiques

Lorsque vous effectuez le couplage aminé allyle, il est essentiel de remettre en suspension le colorant dans le DMSO sous peu (moins de 1 heure) avant l'accouplement et s'assurer eau ne pénètre pas dans le mélange colorant / DMSO, comme il va réagir avec le groupe actif sur le colorant. Ne pas trop sécher l'ARN (peut être séché à 1-2UL plutôt que complètement à sec), et remettre ainsi dans le tampon de couplage. Pendant la réaction de couplage, garder la réaction d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Whitehead Institute Fellows Fonds

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de colorants réactifs CyDye après marquageRéactifGE HealthcareRPN5661Contient les colorants Cy3 et Cy5
Spectrophotomètre UV-VIS NanoDrop ND-1000AutreNanoDropND-1000Ou spectrophotomètre équivalent

Références

  1. Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
  2. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
  3. Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
  4. Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
  5. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
  6. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
  7. Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
  8. Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).

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