Nous décrivons un protocole simple pour identifier les protéines du cerveau qui se lient à l'extrémité C-terminale pleine longueur de l'ATP-dépendants P2X2 récepteurs. L'extension et l'application systématique de cette approche à tous les récepteurs P2X devrait conduire à une meilleure compréhension de la signalisation des récepteurs P2X.
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Article de méthode
Protéomique pour identifier les protéines interagissant avec P2X2 canaux cationiques ligand-dépendants
Dans cet article
Résumé
Résumé
Canaux ioniques ligand-dépendants sous-tendent la communication synaptique dans le système nerveux 1. Chez les mammifères, il existe trois familles de canaux ligand-dépendants: la boucle Cys, le glutamate-dépendants et les canaux récepteurs P2X 2. Dans chaque cas de liaison de l'émetteur conduit à l'ouverture d'un pore à travers lequel les ions couler leurs gradients électrochimiques. Beaucoup de canaux ligand-dépendants sont aussi perméables aux ions calcium 3, 4, qui ont des rôles de signalisation en aval 5 (régulation des gènes par exemple) qui peut dépasser la durée d'ouverture des canaux. Ainsi canaux ligand-dépendants peuvent signal sur des échelles de temps allant de larges quelques millisecondes à quelques jours. Compte tenu de ces rôles importants, il est nécessaire de comprendre comment ligand-mêmes canaux ioniques sont régulés par des protéines, et comment ces protéines peuvent syntoniser la signalisation. Des études récentes suggèrent que beaucoup, sinon toutes, les chaînes peuvent faire partie des complexes de protéines de signalisation 6. Dans cet article, nous expliquons comment identifier les protéines qui se lient à des aspects C-terminale du domaine P2X2 récepteur cytosolique.
Récepteurs P2X sont des canaux cationiques ATP-dépendants et se compose de sept sous-unités (P2X1-P2X7). Récepteurs P2X sont largement exprimés dans le cerveau, où ils servent de médiateurs excitateurs transmission synaptique et la facilitation présynaptique de libération des neurotransmetteurs 7. Récepteurs P2X sont trouvés dans les cellules excitables et non excitables et arbitrer un rôle clé dans la signalisation neuronale, l'inflammation et la fonction cardiovasculaire 8. P2X2 récepteurs sont abondants dans le système nerveux 9 et font l'objet de cette étude. Chaque sous-unité P2X est censé posséder deux segments transmembranaires (TM1 et TM2) séparés par une région extracellulaire et intracellulaire 7 N et C terminales (figure 1a) 7. Sous-unités P2X 10 (P2X1-P2X7) montrent une homologie de séquence de 30-50% au niveau des acides aminés 11. Récepteurs P2X contenir que trois sous-unités, qui est la plus simple parmi les récepteurs ionotropiques stoechiométrie. Le P2X2 C-terminale composée de 120 acides aminés (Fig 1b) et contient plusieurs sites d'accueil pour des protéines de consensus, soutenant l'hypothèse que des récepteurs P2X2 peut-être partie des complexes de signalisation. Cependant, bien que plusieurs fonctions ont été attribuées à l'extrémité C-terminale des récepteurs P2X2 9 aucune étude n'a décrit les partenaires moléculaires qui se couplent à la face intracellulaire de cette protéine par l'intermédiaire de la longueur totale C-terminale. Dans cet article, nous décrivons les méthodes d'une approche protéomique pour identifier les protéines qui interagissent avec la pleine longueur C-terminale de P2X2 récepteurs.
Protocole
Procédures expérimentales
La procédure expérimentale (Fig. 2) se compose de quatre parties qui sont décrits d'une manière graduelle ci-dessous.
Partie 1: Sous-clonage et l'expression de la partie C-terminale du récepteur P2X2.
Nous avons exprimé toute la longueur C-terminale de P2X2 récepteurs dans des bactéries pour identifier les protéines du cerveau à laquelle il se lie.
- Le C-terminale (résidus 353 à 472) du récepteur P2X2 (Fig 1) a été amplifié par PCR, clonées dans pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) et vérifiées avec le séquençage.
- Le plasmide recombinant ....
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Discussion
Les canaux ioniques sont une classe importante de protéines membranaires intégrales. Ils contiennent des pores remplis d'eau que de manière sélective permettre la circulation des ions bas leurs gradients électrochimiques travers la membrane plasmique. Canaux ioniques porte entre ouverte et les états fermé. L'étape de déclenchement est déclenché par les émetteurs (par exemple l'ATP) en cas de canaux ioniques ligand P2X gated, ou il peut être régulé par des interactions avec d'autres protéines. La dernière.......
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Remerciements
SW et TMV sont soutenus par le NHLBI et NCRR au National Institutes of Health. BSK et HS sont soutenus par le NINDS et NIGMS des Instituts nationaux de la Santé.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Acétonitrile | Réactif | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamide | Réactif | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicilline | Réactif | VWR international | VW1507-01 | |
| Bicarbonate d'ammonium | Réactif | Fluka | 09830 | |
| Persulfate d'ammonium (APS) | Réactif | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adénosine triphosphate (ATP) | Réactif | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Réactif de Bradford | Réactif | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bleu de bromophénol | Réactif | Fisher Scientific | B-392 | |
| Comassie bleu R-250 | Réactif | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Dithiothréitol (DTT) | Réactif | EMD Millipore | 3860 | |
| Acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) | Réactif | VWR international | VW1474-01 | |
| Acide éthylèneglycol-tétraacétique (EGTA) | Réactif | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Acide formique | Réactif | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Perles de Glutathion Sépharose 4B | Réactif | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Acide chlorhydrique (HCl) | Réactif | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Réactif | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacétamide | Réactif | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Milieu Luria-Bertani (LB) | Réactif | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptine | Réactif | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lysozyme | Réactif | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Sulfate de magnésium (MgSO4) | Réactif | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Réactif | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Fluorure de sodium (NaF) | Réactif | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Orthovanadate de sodium (Na3VO4) | Réactif | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Réactif | Fluka | 74385 | |
| Phénylméthanesulfonylfluorure (PMSF) | Réactif | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Comprimé inhibiteur de protéase | Réactif | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Standard protéique | Réactif | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Réactif | Acros Organics | 61207 | |
| Flacon à vis | Outil | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Dodécylsulfate de sodium | Réactif | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Solution colorante SYPRO® Ruby pour gel de protéines | Réactif | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,N’-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED) | Réactif | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Base Tris | Réactif | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Réactif | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tripsine | Réactif | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Réactif | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Eau | Réactif | Burdick & Jackson | 365-4 | |
| Spectromètre de masse tandem LTQ-Orbitrap | Outil | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Système de chromatographie liquide nano | Outil | Eksigent | ||
| B-Mercapto–éthanol | Réactif | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycérol | EMD Millipore | GX0185-6 |
Références
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contr....
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Réimpressions et autorisations
