Article de méthode

ES Cell dérivé des cultures cellulaires neuroépithéliales

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DOI :

10.3791/118

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30 novembre 2006

 ,  ,  , 
1McLean Hospital, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

Dérivation de précurseurs d'neuroépithéliales souches embryonnaires (ES), les cellules stromales en utilisant l'activité induisant des cellules dérivées (SDIA).

Résumé

Les cellules ES ont le potentiel de se différencier en cellules de tous les feuillets embryonnaires, ce qui en fait un outil intéressant pour le développement de nouvelles thérapies. En général, la différenciation des cellules ES suit le concept d'abord générer des cellules progénitrices immatures, qui peuvent ensuite être multipliées et différenciées en maturité phénotypes cellulaires. Ceci s'applique également pour les dérivés de cellules ES neurogenèse, dans lequel le développement des cellules neurales suit deux grandes étapes: d'abord, la dérivation et l'expansion des précurseurs immatures neuroépithéliales et deuxièmement, leur différenciation en cellules matures neurones. Une méthode courante pour produire progéniteurs neuronaux à partir des cellules ES est basé sur le corps (EB) la formation embryoïdes, qui révèle la différenciation des cellules de tous les feuillets embryonnaires, y compris neuroectoderme. Une méthode alternative et plus efficace pour induire le développement des cellules stromales neuroépithéliales utilise l'activité induisant des cellules dérivées (SDIA), qui peut être atteint par les cellules ES co-culture avec l'os du crâne dérivées de la moelle des cellules stromales (1). Les deux, la formation EB et SDIA, révèlent le développement de la rosette de structures semblables, qui sont pensés pour ressembler à du tube neural et / ou de la crête neurale, comme géniteurs. Les précurseurs de neurones peuvent être isolés, étendus et différenciées en neurones spécifiques et les cellules gliales en utilisant des conditions de culture définie. Ici, nous décrivons la génération et l'isolement de ces rosettes en co-culture des expériences avec la ligne de cellules stromales MS5 (2-5).

Protocole

Etape 1

  1. Plaque mitomycine C ggrowth-inhibée (10 pg / ml pendant 2,5 heures) MS5 cellules à une densité de 70.000 / cm2 sur la gélatine-couché (0,01% pour 30 minutes) 6 assiettes bien dans α-MEM médias.
  2. Lorsque les cellules sont attachés et ont formé une monocouche (plus de la croissance de nuit), passer à SRM.
  3. Manuellement isoler les colonies de cellules ES à partir des cultures de cellules ES à l'aide d'une seringue avec une aiguille de 27 G ½.
  4. Tritrurate les colonies soigneusement avec une pointe de 1 ml bleu et plaque à faible densité sur les cellules MS5 (habituellement 2-3 colonies par plaque de 6 puits).

Remarque: Les cellules ES peuvent également être prises à partir de propagation enzymatique utilisant la collagénase ou de trypsine.

Etape 2

  1. Cultiver les cellules ES sur la MS5 mangeoires pendant 14-21 jours, jusqu'à rosette contenant former des colonies.


Remarque: Les médias changent souvent. Les rosettes sont généralement à la périphérie des colonies et leur formation peut être grandement améliorée si 300-500 ng / ml Caboche est ajouté à la MRS (3). Dans certains protocoles de différenciation, les MRS peuvent être échangées avec N2-A médias et complétée par la croissance ou d'autres facteurs afin de promouvoir la spécification des cellules (2-5).

Étape 3

  1. Isoler et ramasser les rosettes avec une aiguille de calibre 27 ½ sous un microscope.

Remarque: Evitez de couper et ramasser l'MS5 cellules stromales. Si les colonies sont emballés avec des rosettes, on peut également isoler la colonie entière.


Etape 4

  1. Aspirer les grappes de rosettes, les tritrurate soigneusement avec une pointe de 1 ml bleu, et la plaque eux sur la poly-L-ornithine (0,001%) et de la fibronectine (1 pg / ml) ou de la laminine (1 pg / ml) à revêtement 6 puits dans N2-Un média habituellement complétées avec bFGF (20 ng / ml). Les rosettes seront réforme et l'expansion.

Remarque: Pour améliorer la survie des cellules, on peut l'assiette du petites grappes dans les gouttelettes d'augmenter la densité cellulaire. Cette étape peut également être modifié en complétant la N2-Un média avec une croissance supplémentaires ou d'autres facteurs afin de promouvoir la spécification des cellules (2-5).

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Discussion

Ce protocole démontre les différentes étapes de production et d'isoler les cellules neuro-épithéliales des cellules ES humaines à l'aide de SDIA. L'application de cette méthode est multiple et a été utilisé dans de nombreux protocoles à produire des neurones spécifiés (par exemple 1, 2, 5-9). Les rosettes sont pensé pour ressembler à des cellules du tube neural avec un phénotype antérieure (2, 5, 10) et contiennent aussi des progéniteurs de la crête neurale (11, 12). De plus, ils conservent un certain niveau de plasticité, car i...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
L-glutamineGIBCO, by Life Technologies25030
alpha-MEMGIBCO, by Life Technologies12571
Pénicilline/streptomycineGIBCO, by Life Technologies15140
Knockout-DMEMGIBCO, by Life Technologies10829
Substitut sérique KnockoutGIBCO, by Life Technologies10828
Solution d'acides aminés non essentiels MEMGIBCO, by Life Technologies12383
DMEM/F12GIBCO, by Life Technologies11330
Supplément N2-AStem Cell Technologies07152
Mitomycine-CSigma-AldrichM0503
Gélatine de type ASigma-AldrichG1890
Poly-L-ornithineSigma-AldrichP4957solution à 0,01 %
LaminineSigma-AldrichL-2020
FibronectineSigma-AldrichF2006
Facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF)Invitrogen13256
Seringue de 1 mL avec aiguille 27 1/2 GBD Biosciences309623
Milieu N2-AmilieuDMEM/F12 + 1 % de supplément N2-A
Milieu de remplacement sérique (SRM)milieuKnockout-DMEM + 20 % de substitut sérique Knockout + 1 % de solution d'acides aminés non essentiels MEM + 2 mM L-glutamine
Milieu α-MEMmilieuα-MEM + 10 % de FBS + 2 mM L-glutamine + 1 % de pénicilline/streptomycine
MS5ligne cellulairecellules stromales
Micromètre
Plaques 6-puitspour culture tissulaire

Références

  1. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
  4. Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
  5. Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
  6. Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
  7. Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
  8. Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
  9. Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
  10. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  11. Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
  12. Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).

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Mots-clés

Diff renciation des cellules EScellules neuro pith lialesformation de corps embryo desactivit d induction d riv e de cellules stromalesstructures en rosetteisolement de prog niteurs neurauxexp riences de co culturecellules stromales MS5prog niteurs du tube neuralprog niteurs de la cr te neurale

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