Dérivation de précurseurs d'neuroépithéliales souches embryonnaires (ES), les cellules stromales en utilisant l'activité induisant des cellules dérivées (SDIA).
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Article de méthode
ES Cell dérivé des cultures cellulaires neuroépithéliales
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules ES ont le potentiel de se différencier en cellules de tous les feuillets embryonnaires, ce qui en fait un outil intéressant pour le développement de nouvelles thérapies. En général, la différenciation des cellules ES suit le concept d'abord générer des cellules progénitrices immatures, qui peuvent ensuite être multipliées et différenciées en maturité phénotypes cellulaires. Ceci s'applique également pour les dérivés de cellules ES neurogenèse, dans lequel le développement des cellules neurales suit deux grandes étapes: d'abord, la dérivation et l'expansion des précurseurs immatures neuroépithéliales et deuxièmement, leur différenciation en cellules matures neurones. Une méthode courante pour produire progéniteurs neuronaux à partir des cellules ES est basé sur le corps (EB) la formation embryoïdes, qui révèle la différenciation des cellules de tous les feuillets embryonnaires, y compris neuroectoderme. Une méthode alternative et plus efficace pour induire le développement des cellules stromales neuroépithéliales utilise l'activité induisant des cellules dérivées (SDIA), qui peut être atteint par les cellules ES co-culture avec l'os du crâne dérivées de la moelle des cellules stromales (1). Les deux, la formation EB et SDIA, révèlent le développement de la rosette de structures semblables, qui sont pensés pour ressembler à du tube neural et / ou de la crête neurale, comme géniteurs. Les précurseurs de neurones peuvent être isolés, étendus et différenciées en neurones spécifiques et les cellules gliales en utilisant des conditions de culture définie. Ici, nous décrivons la génération et l'isolement de ces rosettes en co-culture des expériences avec la ligne de cellules stromales MS5 (2-5).
Protocole
Etape 1
- Plaque mitomycine C ggrowth-inhibée (10 pg / ml pendant 2,5 heures) MS5 cellules à une densité de 70.000 / cm2 sur la gélatine-couché (0,01% pour 30 minutes) 6 assiettes bien dans α-MEM médias.
- Lorsque les cellules sont attachés et ont formé une monocouche (plus de la croissance de nuit), passer à SRM.
- Manuellement isoler les colonies de cellules ES à partir des cultures de cellules ES à l'aide d'une seringue avec une aiguille de 27 G ½.
- Tritrurate les colonies soigneusement avec une pointe de 1 ml bleu et plaque à faible densité sur les cellules MS5 (habituellement 2-3 colonies par plaque de 6 puits).
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Discussion
Ce protocole démontre les différentes étapes de production et d'isoler les cellules neuro-épithéliales des cellules ES humaines à l'aide de SDIA. L'application de cette méthode est multiple et a été utilisé dans de nombreux protocoles à produire des neurones spécifiés (par exemple 1, 2, 5-9). Les rosettes sont pensé pour ressembler à des cellules du tube neural avec un phénotype antérieure (2, 5, 10) et contiennent aussi des progéniteurs de la crête neurale (11, 12). De plus, ils conservent un certain niveau de plasticité, car i.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| Pénicilline/streptomycine | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Substitut sérique Knockout | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| Solution d'acides aminés non essentiels MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| Supplément N2-A | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomycine-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Gélatine de type A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | solution à 0,01 % | |
| Laminine | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectine | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| Seringue de 1 mL avec aiguille 27 1/2 G | BD Biosciences | 309623 | ||
| Milieu N2-A | milieu | DMEM/F12 + 1 % de supplément N2-A | ||
| Milieu de remplacement sérique (SRM) | milieu | Knockout-DMEM + 20 % de substitut sérique Knockout + 1 % de solution d'acides aminés non essentiels MEM + 2 mM L-glutamine | ||
| Milieu α-MEM | milieu | α-MEM + 10 % de FBS + 2 mM L-glutamine + 1 % de pénicilline/streptomycine | ||
| MS5 | ligne cellulaire | cellules stromales | ||
| Micromètre | ||||
| Plaques 6-puits | pour culture tissulaire |
Références
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Perrier, A. L., et al. Derivation....
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