Dissection fine et globale de l'épithélium sensoriel de l'oreille interne adultes poisson zèbre ( Danio rerio)

Résumé

L'épithélium sensoriel de l'oreille interne de poisson zèbre adulte est un bon modèle pour comprendre les mécanismes de la régénération des cellules de cheveux chez les vertébrés adulte. Ce protocole démontre la dissection fine de l'épithélium, à travers lequel nous pouvons obtenir des échantillons de tissus pour étudier les événements de régénération au niveau cellulaire et subcellulaire.

Résumé

Neurosensoriels épithélium de l'oreille interne sont les structures essentielles pour les fonctions de l'ouïe et l'équilibre. Par conséquent, il est important de comprendre les caractéristiques moléculaires et cellulaires de l'épithélium, qui sont principalement composés de deux types de cellules: cellules ciliées (HC) et les cellules de soutien (SCS). Ici nous choisissons d'étudier l'épithélium sensoriel dans l'oreille interne de poisson zèbre adulte, non seulement parce que les structures épithéliales sont hautement conservée chez tous les vertébrés étudiés, mais aussi parce que le poisson zèbre adulte est capable de régénérer HC, une capacité qui mammifères perdent peu après la naissance. Nous utilisons l'oreille interne des poissons zèbres adultes comme un système modèle pour étudier les mécanismes de l'oreille interne HC régénération dans les vertébrés adultes qui pourraient être utiles pour la thérapie clinique de l'audition / équilibre des déficits dans l'homme comme un résultat de la perte de HC.

Ici, nous montrer comment faire des dissections globale et fine de l'épithélium sensoriel dans l'oreille interne de poisson zèbre adulte. La dissection brute supprime les tissus entourant l'oreille interne et est utile pour préparer des coupes de tissus, ce qui nous permet d'examiner la structure détaillée de l'épithélium sensoriel. La dissection fines nettoie les tissus non-sensori-épithéliales de l'épithélium de chaque individu et nous permet d'examiner l'hétérogénéité de l'épithélium ensemble facilement dans l'ensemble de montage des échantillons épithéliales.

Protocole

Partie 1: Préparation du tissu

1. Euthanasier le poisson zèbre adulte avec tamponné MS-222 (éthyl 3-aminobenzoate sel méthanesulfonate, 0,03%).
2. Décapiter le poisson. Coupez la mâchoire inférieure, placer la tête sur le pavé de dissection avec la face ventrale en place, et à immobiliser le tissu avec des épingles insectes. Enlever les tissus mous ventrale du crâne et du crack ouvrir la partie ventrale de la capsule crâne avec une paire de pinces fines sous un microscope de dissection.
3. Fixer la tête du poisson dans du paraformaldéhyde (4%) à 4 ° C pendant la nuit.
4. Rincez la tête du poisson fixés dans du PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X) 3 fois, 5 minutes chaque fois.

Partie 2: dissection brut de l'oreille interne

1. Placez la tête du poisson sur le pavé de dissection avec la place face ventrale. L'immobiliser avec des épingles insectes. Toutes les étapes suivantes sont effectuées sous le microscope de dissection.
2. Avec une paire de pinces fines, enlever l'os du crâne au cours de l'oreille interne et retirez soigneusement les tissus oreille interne: saccules, lagenae, et utricules. Le saccule et Lagena sont étroitement attachent les uns aux autres et ainsi sortir ensemble tout l'utricule (antérieur à la saccule et Lagena), va très probablement se détacher de l'autre bout organes lors de la dissection.
3. Mettez les tissus oreille interne, dans du PBS (1X). Si aucune dissection amende supplémentaire est nécessaire, rincer le tissu 2-3 fois avec du PBS (1X) et il peut être utilisé pour d'autres expériences, par exemple cryocoupes.

Partie 3: la dissection fine de l'épithélium sensoriel oreille interne

1. La dissection fine peut être effectuée dans une goutte de PBS (1X) sur une lame de verre propre.
2. Retirer les otolithes utriculaire de l'utricule avec deux paires de pinces fines, et, si désiré, couper le tissu non-sensorielle épithéliales et l'innervation de l'épithélium avec une paire de pinces fines et d'une lame d'aiguille.
3. Retirer les otolithes lagenar avant de se séparer et sacculaire lagenar épithélium alors essayez de garder le saccule toute aussi intact que possible. Placez le tissu dans la chute de PBS avec jusqu'à la face ventrale. Utiliser la lame d'aiguille à couper soigneusement entre les saccule et Lagena. Coupez l'excès de non-sensorielle tissu épithélial et le innvervation avec des pincettes fine et la lame d'aiguille, si désiré.

Partie 4: coloration fluorescente des cellules ciliées sensorielles dans le épithélium

1. Rincer l'épithélium sensoriel avec PBT (1XPBS et 1% de Triton X-100) pour 3 fois, 5 minutes chaque fois.
2. Incuber avec l'épithélium fluophore phalloïdine marquée (par exemple la farine Alexa 488 phalloïdine, la dilution 1:1000) pendant 30 min à température ambiante.
3. Rincer l'épithélium sensoriel avec PBT pour 3 fois, 10 minutes chaque fois.
4. Montez les épithélia sur une lame avec milieu de montage et de vérifier le tissu taché sous le microscope à fluorescence avec des filtres de longueur d'onde appropriée.
5. Après dissection de succès et de la coloration, l'épithélium intact avec coloration des cheveux forts ensemble de cellules peuvent être vus au microscope (fig. 1).

Figure 1. Les cellules ciliées de l'épithélium sacculaire sensorielles ont été colorés avec Alexa Farine 488 phalloïdine (Vert). L'échantillon de tissu a été disséqué et colorées comme mentionné dans le document. Plusieurs photos ont été prises à différentes positions de l'échantillon et carrelée avec Adobe Photoshop 7.0.
Barre d'échelle = 150μm.

Discussion

Dans ce protocole, nous avons décrit la dissection fine et globale de l'épithélium sensoriel de l'oreille interne de poisson zèbre adulte, ce qui nous permet de préparer l'échantillon de tissu pour l'étude des fonctions cellulaires et subcellulaires de l'épithélium sensoriel.

Afin de réaliser une dissection de succès, la toute première étape, la fixation, est très importante. Assurez-vous que vous utilisez toujours une solution de paraformaldéhyde fraîchement préparés par...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MS222 (sel de méthanesulfonate d'éthyle 3-aminobenzoate)	Réactif	Sigma-Aldrich	A5040
PBS (solution saline tamponnée au phosphate, 10X)	Réactif	Mediatech, Inc.	46-013-CM
Paraformaldéhyde	Réactif	Sigma-Aldrich	P-6148
Triton X-100	Réactif	Sigma-Aldrich	T8787
Alexa Fluor 488 phalloidine	Réactif	Invitrogen	A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	Réactif	Vector Laboratories	H-1500
Microscope de dissection	Microscope	Nikon Instruments	SMZ1000
Épingles à insectes	Outil	Fine Science Tools	26000-40
Ciseaux	Outil	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Pincettes	Outil	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045
Lame d’aiguille	Outil	Sharpoint	78-6810
Microscope à fluorescence	Microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
Plaque de dissection	Outil	eNasco	SB07840M
Poisson zèbre	Animal	Divers	n/a