L'exocytose imagerie dans les cellules bipolaires rétine par microscopie TIRF

Résumé

Dans cette vidéo, nous démontrons comment étiqueter et de visualiser seule exocytose des vésicules synaptiques et la traite des cellules rétiniennes bipolaires poissons rouges en utilisant la fluorescence totale internes réflectance (FRBR) microscopie.

Résumé

Réflectance interne totale de fluorescence (FRBR) microscopie est une technique qui permet l'étude des événements qui se déroulent à la membrane cellulaire, l'imagerie par sélectif des molécules fluorescentes qui sont proches d'une substance indice de réfraction élevé, comme le verre

Protocole

Partie 1: Dissection et isolement des cellules bipolaires

1. Préparer des solutions énumérées dans le tableau 2; Le pH de sonneries '(extérieurs) des solutions devraient être ajusté à 7,4 avec NaOH et le pH de la solution interne devrait être ajusté à 7,2 avec CsOH. Protéger la solution interne de la lumière avec du papier aluminium et gardez à 4 ° C jusqu'à leur utilisation;
2. Dark-adapter un poisson rouge pendant au moins 30 minutes avant la dissection;
3. Alors que l'animal s'adapte sombre, préparer 5 ml de hyaluronidase (V hyaluronidase type, 1100 unités / ml à faible Ca ^{2 +} de Ringer; Sigma, St. Louis, MO) et 10 ....

Discussion

Les avantages de l'objectif de type microscopie TIRF sont que 1) il fournit une excellente sectionnement optique en limitant la lumière d'excitation à une région étroite dans le plan focal de l'objectif, minimisant ainsi les focus-du-léger; 2) car la lumière tombe exponentiellement avec la distance , le mouvement dans une direction verticale peut être surveillé comme un changement dans l'intensité de fluorescence; 3) la collecte efficace de la lumière à travers l'objectif d'ouverture numérique élevée ^1,5. .......