Article de méthode

Grand Insérer production bibliothèque génomique de l'environnement

DOI :

10.3791/1387

⸱

23 septembre 2009

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1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Dans cet article

Résumé

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Construction d'une bibliothèque fosmide avec l'ADN génomique environnementale isolé du continuum profondeur verticale d'un fjord saisonnière hypoxiques est décrite. La bibliothèque clone résultant est capté dans les plaques 384 puits et archivées pour le séquençage et l'aval de criblage fonctionnel par l'application d'un système de picking colonie automatisés.

Résumé

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La grande majorité des microbes dans la nature restent actuellement inaccessibles aux méthodes de culture traditionnelles. Au cours des dix dernières années, la culture indépendante génomique environnementale (

Protocole

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Construction de la bibliothèque fosmide a été divisé en quatre étapes principales et sous-divisé en plusieurs parties (voir Fig.1 pour un aperçu).

Etape I (voir "l'extraction d'ADN à partir de 0,22 uM filtres Sterivex« protocole [3])

Partie 1: lyse cellulaire catalysée par une enzyme

Partie 2: Purification de l'ADN de l'environnement par centrifugation en gradient de densité de CsCl et de récupération de l'ADN

Partie 3: Contrôle de la qualité de l'ADN extrait par électrophorèse sur gel

Étape II

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Discussion

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Une procédure est décrite la manière la plus efficace de générer une grande bibliothèque-insert fosmide avec l'ADN génomique provenant d'un échantillon des eaux côtières. En amont d'extraction d'ADN génomique est décrit dans un protocole séparé [3].

Comme la production fosmide-bibliothèque est un multi-processus, le plan d'au moins deux à trois semaines à temps pour toute la procédure, y compris toutes les étapes quatre présentées. L'extraction de l'ADN génomique .......

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Déclarations de divulgation

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Je n'ai rien à déclarer.

Remerciements

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Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l'innovation, le Fonds de développement des connaissances en Colombie-Britannique et les sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada pour soutenir les études en cours sur les régions pauvres en oxygène des eaux côtières et océaniques ouverts. MT et SL ont été soutenus par des bourses de la Fondation du Centre TULA financé pour la diversité microbienne et évolution (cmde). MT a également reçu le soutien de la bourse de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

....

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Matériaux

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Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Step II
CopyControl™ ; Kit de production de bibliothèque de fosmidesEpicentre BiotechnologiesCCFOS110suffisant pour générer 9-10 bibliothèques de fosmides
SeaPlaque AgaroseCambrex50100
chauffante d’agitationCorningPC-420D
1.0X TAE Tampon
CHEF Mapper XA Système d’électrophorèse à champ pulsé comprenant module de refroidissement et pompe àvitesse variableBio-Rad
λ ; DNA-HindIII DigestNew England BiolabsN3012S
MidRange I Marqueur PFGNew England BiolabsN3551S
10,000X SYBR GoldInvitrogenS11494
pellicule plastique micro-ondableSaran premium wrap
Safe Imager transilluminatorInvitrogenS37102
GELase Agarose Gel-Digestion PréparationEpicentre BiotechnologiesG09100
scalpelFisher Scientific08-927-5D
Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-4 avec membrane Ultracel-10EMD MilliporeUFC801024
Microcon YM-30 Unité de filtration centrifuge EMD Millipore42410
eau sans nucléaseAmbionAM9932
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 dosages*#InvitrogenP7589
chauffe-eau numériqueVWR international12621-088
VWR international14231-854
centrifugeuse Beckman Coulter Inc.Rotor centrifuge Avanti J-E
Beckman Coulter Inc.Centrifugeuse de table JA 5.3
Eppendorf5415D
microcentrifugeuse tubes, 1,7 mL, transparentAxygen ScientificMCT-175-C
15 mL tubes à centrifuger Fisher Scientific430052
Step III
LBFisher ScientificBP 1426-2
Step IV
3370)
384 Plaque de puits avec couvercleFisher Scientific07201157(3680)
Boîtes de Pétri 100 D.E. x 15mm HFisher Scientific08-757-12
Boîtes de Pétri 150 Dia. x 15mmHFisher Scientific08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mmVWR internationalCABD351040
glycérolSigma-AldrichG5516
chloramphénicolSigma-AldrichC0378
LB bouillonFisher ScientificBP 1426-2
Difco AgarBD Biosciences214530
billes de verreFisher Scientific10-310-1
QFill3GenetixX3050
BleachJavex
ÉthanolSigma-AldrichE7023
15 mL tubes à centrifugerFisher Scientific430052
QPix TêteGenetixQPix2
(E. coli) GenetixX4006
plaque de fonctionnementbain-marieTampon de dilution de phage MgSOSigma-Aldrich M2643 10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgClcryogénique Fisher Scientific 43048896 plaque de puits avec couvercle Fisher Scientific CS003370( de prélèvement

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.

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Mots-clés

Environmental Genomic LibraryFosmid Library ProductionPulsed Field Gel ElectrophoresisDNA End RepairGel ExtractionPhage PackagingAutomated Colony PickingChloramphenicol SelectionEPI300T1 Resistant CellsQpix2 Robot

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