Construction d'une bibliothèque fosmide avec l'ADN génomique environnementale isolé du continuum profondeur verticale d'un fjord saisonnière hypoxiques est décrite. La bibliothèque clone résultant est capté dans les plaques 384 puits et archivées pour le séquençage et l'aval de criblage fonctionnel par l'application d'un système de picking colonie automatisés.
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Article de méthode
Grand Insérer production bibliothèque génomique de l'environnement
Dans cet article
Résumé
Résumé
La grande majorité des microbes dans la nature restent actuellement inaccessibles aux méthodes de culture traditionnelles. Au cours des dix dernières années, la culture indépendante génomique environnementale (
Protocole
Construction de la bibliothèque fosmide a été divisé en quatre étapes principales et sous-divisé en plusieurs parties (voir Fig.1 pour un aperçu).
Etape I (voir "l'extraction d'ADN à partir de 0,22 uM filtres Sterivex« protocole [3])
Partie 1: lyse cellulaire catalysée par une enzyme
Partie 2: Purification de l'ADN de l'environnement par centrifugation en gradient de densité de CsCl et de récupération de l'ADN
Partie 3: Contrôle de la qualité de l'ADN extrait par électrophorèse sur gel
Étape II
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Discussion
Une procédure est décrite la manière la plus efficace de générer une grande bibliothèque-insert fosmide avec l'ADN génomique provenant d'un échantillon des eaux côtières. En amont d'extraction d'ADN génomique est décrit dans un protocole séparé [3].
Comme la production fosmide-bibliothèque est un multi-processus, le plan d'au moins deux à trois semaines à temps pour toute la procédure, y compris toutes les étapes quatre présentées. L'extraction de l'ADN génomique .......
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Déclarations de divulgation
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Remerciements
Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l'innovation, le Fonds de développement des connaissances en Colombie-Britannique et les sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada pour soutenir les études en cours sur les régions pauvres en oxygène des eaux côtières et océaniques ouverts. MT et SL ont été soutenus par des bourses de la Fondation du Centre TULA financé pour la diversité microbienne et évolution (cmde). MT a également reçu le soutien de la bourse de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Étape II | |||
| Kit de production de bibliothèque de fosmides CopyControl™ | Epicentre Biotechnologies | CCFOS110 | suffisant pour générer 9 à 10 bibliothèques de fosmides |
| Agarose SeaPlaque | Cambrex | 50100 | |
| Plaque chauffante agitateur | Corning | PC-420D | |
| Solution tampon de migration 1,0X TAE | |||
| Système d'électrophorèse en champ pulsé CHEF Mapper XA, comprenant module de refroidissement et pompe à vitesse variable | Bio-Rad | ||
| Digestion de l'ADN λ par HindIII | New England Biolabs | N3012S | |
| Marqueur PFG MidRange I | New England Biolabs | N3551S | |
| SYBR Gold 10 000X | Invitrogen | S11494 | |
| Plastique micro-ondable | Saran premium wrap | ||
| Transilluminateur Safe Imager | Invitrogen | S37102 | |
| Préparation GELase pour la digestion de gel d'agarose | Epicentre Biotechnologies | G09100 | |
| Lame de scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-4 avec membrane Ultracel-10 | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Unité de filtration centrifuge Microcon YM-30 | EMD Millipore | 42410 | |
| Eau sans nucléase | Ambion | AM9932 | |
| Kit d'essai Quant-iT PicoGreen dsDNA *2000 dosages*# | Invitrogen | P7589 | |
| Chauffe-bloc numérique à sec | VWR international | 12621-088 | |
| Bain-marie | VWR international | 14231-854 | |
| Centrifugeuse | Beckman Coulter Inc. | Avanti J-E | |
| Rotateur de centrifugeuse | Beckman Coulter Inc. | JA 5.3 | |
| Centrifugeuse de table | Eppendorf | 5415D | |
| Tubes microcentrifugeurs, 1,7 mL, transparents | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Tubes centrifugeurs de 15 mL | Fisher Scientific | 430052 | |
| Étape III | |||
| Bouillon LB | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Solution tampon de dilution de bactériophages | 10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | ||
| Vials cryogéniques | Fisher Scientific | 430488 | |
| Étape IV | |||
| Plaque 96 puits avec couvercle | Fisher Scientific | CS003370(3370) | |
| Plaque 384 puits avec couvercle | Fisher Scientific | 07201157(3680) | |
| Boîtes de Pétri 100 mm de diamètre x 15 mm de hauteur | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Boîtes de Pétri 150 mm de diamètre x 15 mm de hauteur | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| BD Falcon BioDish XL 245 x 245 mm | VWR international | CABD351040 | |
| Glycérol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphénicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Bouillon LB | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| Agar Difco | BD Biosciences | 214530 | |
| Billes de verre | Fisher Scientific | 10-310-1 | |
| QFill3 | Genetix | X3050 | |
| Eau de Javel | Javex | ||
| Éthanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Tubes centrifugeurs de 15 mL | Fisher Scientific | 430052 | |
| Prélèveur de colonies QPix | Genetix | QPix2 | |
| Embout de prélèvement (E. coli) | Genetix | X4006 |
Références
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.
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Réimpressions et autorisations
