Pour faire des lentivirus, des vecteurs d'ADN sont transfectés dans les cellules humaines 293. Après la récolte et la concentration du surnageant, le titre viral est déterminé par l'expression de fluorescence avec un cytomètre en flux.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
L'interférence ARN (ARNi) est un système d'inactivation des gènes dans les cellules vivantes. Dans l'ARNi, les gènes homologues en séquence à court ARN interférents (siRNA) sont réduits au silence à l'état post-transcriptionnel. ARN en épingle à cheveux courts, des précurseurs de siARN, peut être exprimé en utilisant des lentivirus, permettant l'ARNi dans une variété de types cellulaires. Les lentivirus, comme le virus de l'immunodéficience humaine, sont capables d'infecter à la fois la division et non de division des cellules. Nous allons décrire une procédure pour lentivirus colis. Emballage se réfère à la préparation de virus compétents de vecteurs d'ADN. Lentiviraux systèmes de production de vecteurs sont basés sur un «split» du système, où le génome viral naturel a été divisée en des constructions individuelles d'aide plasmide. Ce fractionnement des différents éléments viraux en quatre vecteurs séparés diminue le risque de créer un virus capable de réplication-par recombinaison fortuite du génome lentiviral. Ici, un vecteur contenant le shRNA d'intérêt et de trois vecteurs d'emballage (p-VSVG, pRSV, pMDL) sont transfectées de façon transitoire dans les cellules humaines 293. Après au moins une période d'incubation de 48 heures, le surnageant contenant le virus est récolté et concentrée. Enfin, le titre viral est déterminé par le journaliste (fluorescent) l'expression d'un cytomètre en flux.
Protocole
Partie 1: La transfection de cellules HEK 293 cellules à produire de lentivirus
* 24 heures avant la transfection, plaque 2,5 x 10 6 cellules dans un plat de 10cm pour une confluence de 50-70% le jour suivant.
- Démarrer ce protocole par la préparation de l'ADN avec lequel on sera plus tard son transfecter des cellules de rendre le virus. Premièrement, diluer FuGENE 6 réactif de transfection Roche, un réactif lipidique qui rendent les cellules prennent l'ADN. Dans un tube de 1,5 ml, pipette 30μl FuGENE 6 dans 600ul milieu sans sérum (SFDMEM). Soyez prudent de ne pas laisser FuGENE toucher le côté du tube, comme....
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Remerciements
Sandler base de l'asthme Research Center (SABRE)
Sandler Foundation
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM cellules HEK 293T Pénicilline-streptomycine Glutamine Solution saline tamponnée au phosphate FBS | Invitrogen | ||
| Réactif de transfection FuGENE 6 pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG | Roche Group | ||
| Eau de Javel | Clorox | ||
| Plaques de culture cellulaire de 10 cm Plaques de culture cellulaire de 96 puits | Falcon BD | 353003 | |
| Pipette multicanal | Rainin | ||
| Pointes de pipette filtrées | Rainin | ||
| Tubes Eppendorf de 1,5 ml Seringue Filtre seringue (0,45-μm) | Eppendorf | ||
| Tubes d'ultracentrifugation | Beckman Coulter Inc. | ||
| Incubateur de culture tissulaire à 5 % de CO2 | Coulter | ||
| Rotateur Beckman SW41T.I | |||
| Ultracentrifugeuse Beckman | Beckman Coulter Inc. | ||
| Microscope à fluorescence | Coulter | ||
| FACS Array | Beckman Coulter Inc. |
Références
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
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Réimpressions et autorisations
