La protéine SC1 agit par inhibition double de Ras-GAP et d'ERK1. Nous avons évalué la fonction de SC1 dans le maintien de l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires murines en l'absence de LIF, et avons montré que SC1 est capable de maintenir l'auto-renouvellement des cultures de cellules souches embryonnaires murines.
Article de méthode
L'utilisation du SC1 (Pluripotin) pour soutenir l'auto-renouvellement des mESC en l'absence de LIF
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules souches embryonnaires (ES) de souris sont habituellement cultivées avec un facteur d'inhibition de la leucémie (LIF) pour maintenir leur auto-renouvellement.1Cependant, le LIF est coûteux et l'activation de la voie LIF/JAK/STAT3 n'est pas absolument nécessaire pour maintenir l'état d'auto-renouvellement.2La molécule SC1 pourrait constituer une alternative économique au facteur de leucémie inhibiteur (LIF). La molécule SC1 agit par inhibition double de Ras-GAP et d'ERK1.3Illustration de son mécanisme d'action, ce qui en fait un outil utile pour étudier le mécanisme moléculaire fondamental de l'auto-renouvellement. Ici, nous démontrons la procédure de culture de cellules souches embryonnaires murines en présence de SC1 et montrons qu'elles sont capables de maintenir l'auto-renouvellement en l'absence de LIF. Les cellules cultivées avec SC1 présentaient une morphologie similaire à celle des cellules maintenues avec LIF. Les deux présentaient une morphologie typique des cellules souches embryonnaires murines après cinq passages. L'expression de marqueurs typiques de pluripotence (Oct4, Sox2, Nanog et SSEA1) a été observée après cinq passages en présence de SC1. De plus, SC1 n'a causé aucune toxicité apparente sur les cellules souches embryonnaires murines.
Protocole
1. Préparation des plaques de cellules nourricières MEF
- Un jour avant la culture des cellules ES, décongelez un flacon de cellules sérotonineuses MEF CF-1 E14,5 irradiées (voir notre protocole sur la décongélation des cellules ES).
- Ensemencez les cellules sérotonineuses MEF à une densité de 10 000 cellules par puits dans une plaque de 12 puits. Incubez les cellules toute la nuit à 37 °C et 5 % CO2. Milieu pour cellules MEF : DMEM supplémenté avec 10 % de PBS-ES, 1X de glutamine et 1X d'acides aminés non essentiels.
2. Maintien de l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires de souris
- Détacher les cellules ES à l’aide de trypsine. Ensemencer les cellules à une densité de 50 000 cellules/puits sur des plaques de cellules nourricières MEF préparées au préalable, dans un milieu de croissance (Knockout MEM complété avec 15 % de KSR, 4 mM de L-glutamine, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels et 1X BME) supplémenté avec du SC1 à la concentration souhaitée (nous avons utilisé 100 nM, 300 nM et 1 μM). Nous avons également ajouté un puits témoin positif supplémenté avec 1000 μ/ml de LIF. Incuber les cellules toute la nuit à 37 °C et 5 % CO2.
- Entretenir les cellules à 37 °C et 5 % CO2 pendant 3 à 4 jours à chaque passage. Renouveler le milieu toutes les 48 heures.
- Passager les cellules à un ratio de 1:10 à 1:15 à l’aide de trypsine afin de maintenir une densité similaire à celle du semis initial. Après 5 passages, les cellules peuvent être analysées pour l'expression des marqueurs typiques de pluripotence par immunocytochimie.
3. Examen immunocytochimique des marqueurs de pluripotence
- Laver doucement les cellules trois fois avec du PBS.
- Fixer les cellules avec 500 μl de fixateur pendant 20 minutes à température ambiante.
- Laver doucement les cellules trois fois avec du PBS.
- Bloquer la liaison non spécifique avec 500 μl de tampon de blocage pendant une heure à température ambiante.
- Incuber les cellules avec 250 μl d'anticorps primaire spécifique (nous avons utilisé Nanog, Sox2, SSEA1 et Oct4 aux dilutions suivantes : 1:500, 1:2000, 1:500 et 1:500).
- Laver doucement les cellules trois fois avec du PBS.
- Incuber les cellules avec 250 μl d'anticorps secondaire pendant deux heures à température ambiante, à l'abri de la lumière (nous avons utilisé un anticorps secondaire de âne anti-souris conjugué à Alexa Fluor® 555 à 1:2000 et un anticorps secondaire de âne anti-lapin conjugué à Alexa Fluor® 488 à 1:2000).
- Laver doucement les cellules trois fois avec du PBS.
- Ajouter du DAPI (concentration finale de 1 μg/ml) au dernier lavage et incuber pendant 5 minutes pour visualiser les noyaux.
- Analyser les cellules au microscope à fluorescence.
4. Résultats représentatifs :
1. Résultats de la morphologie :
Les cellules souches embryonnaires de souris (ESC R1) ont été cultivées sur des cellules nourricières MEF en présence de LIF ou de SC1 afin de maintenir l'auto-renouvellement à un stade indifférencié. Après le deuxième passage, une différenciation pouvait être observée chez les cellules ne recevant ni LIF ni SC1 (contrôle négatif), et après 5 passages, essentiellement aucune colonie indifférenciée n'était observée. Les colonies traitées au LIF (contrôle positif) sont restées à un stade indifférencié tout au long des 5 passages cellulaires. Les cellules traitées au SC1 à des concentrations de 300 nM ou 100 nM sont également restées indifférenciées après 5 passages, cependant, les cellules traitées avec 1 μM de SC1 ont subi une mort cellulaire après le quatrième passage. (fig. 2 de la note d'application) Le tableau 1 résume les observations morphologiques.
2. Expression des marqueurs de pluripotence
Des cellules souches embryonnaires de souris maintenues pendant 5 passages ont été fixées et examinées par immunocytochimie pour SSEA1, Oct4, Nanog et Sox2. L'expression des marqueurs était similaire à celle des cellules maintenues en présence de LIF. (fig. 3 et 4 de la note d'application)
Figure 1 : Comparaison de la morphologie des cellules maintenues en présence de LIF ou de SC1. Aucune différence de morphologie n'a été observée.
Figure 2 et Figure 3 : Coloration des cellules souches embryonnaires pour Nanog, SSEA1, Sox2 et Oct4, maintenues avec SC1 ou LIF (figure 4 de la note d'application). Les cellules maintenues en présence de SC1 présentent une expression des marqueurs de pluripotence similaire à celle des cellules maintenues en présence de LIF.
Tableau 1
| Témoin négatif | Témoin positif LIF | SC1 1 µM | SC1 300 nM | SC1 100 nM | |
| 1er passage | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES |
| 2e passage | Quelques morphologies différenciées | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES |
| 3e passage | Majorité des cellules différenciées | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES |
| 4e passage | Aucune colonie de CSE | Morphologie normale des cellules ES | Mort cellulaire observée | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES |
| 5e passage | Différenciées | Morphologie normale des cellules ES | Mort cellulaire observée | Morphologie normale des cellules ES | Morphologie normale des cellules ES |
Discussion
La petite molécule SC1 peut être utilisée pour maintenir l'auto-renouvellement à l'état indifférencié des cellules souches embryonnaires murines. Toutefois, avant utilisation sur une lignée cellulaire non testée, il convient de la titrer afin de déterminer la concentration optimale. Par exemple, nous avons testé trois concentrations sur la lignée de cellules souches embryonnaires murines ESC R1. Les concentrations de 100 nM et 300 nM ont permis de maintenir les cellules souches embryonnaires murines, tandis qu'une concentration de 1 μM s'est révélée toxique.
SC1 peut également être utilisé dans des conditions sans cellules nourricières.
Déclarations de divulgation
Les auteurs de cet article sont employés par Stemgent, société qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Sheng Ding de l'Institut de recherche Scripps et le Dr Hongkui Deng de l'Université de Pékin pour leur aide et leurs orientations.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| SC1 | Stemgent | 04-0011 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| anticorps SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | 21702 | |
| anticorps Nanog | Abcam | ab21603 | |
| anticorps Sox2 | Chemicon International | Ab5603 | |
| anticorps Oct4 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-5279 |
Références
- Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).
Réimpressions et autorisations
