Méthodes pour l'étude de l'Barbel Zebrafish maxillaire

Résumé

Le poisson zèbre barbillon maxillaire est un organe des sens tégumentaires contenant ectodermique, mésodermique et dérivés de la crête neurale. Surtout, le barbeau adulte peut se régénérer après une amputation proximale. Cette vidéo présente le développement maxillaire barbeau et démontre un protocole chirurgical pour induire la régénération, suivie par imagerie de collecte, l'intégration et en aval de spécimens barbeau.

Résumé

Barbillons sont phanères sensorielle trouve dans les poissons, les reptiles et les amphibiens. Le poisson zèbre, Danio rerio, développe deux paires de barbillons-une paire de courte nasale et une paire plus maxillaires. Barbel tissus contient des cellules d'origine ectodermique, mésodermique et l'origine de la crête neurale, y compris les cellules de peau, les glandes, les papilles, les mélanocytes, les navires circulatoires et des nerfs sensoriels. Contrairement à la plupart des tissus adultes, le barbillon maxillaire est optiquement clair, nous permettant de visualiser le développement et la maintenance de ces types de tissus tout au long du cycle de vie.

Cette vidéo montre le développement précoce de l'barbillon maxillaire (en commençant un mois environ après la fécondation), et démontre un protocole chirurgical pour favoriser la régénération de l'appendice pour adultes (> 3 mois après la fécondation). Brièvement, le barbeau maxillaire gauche d'un poisson anesthésié est élevée avec une pince stérile juste distal à la face caudale du maxillaire. Une amende, des ciseaux à ressort stérile est positionné contre la pince pour couper l'arbre le barbeau à ce niveau, l'établissement d'un repère anatomique pour le plan de l'amputation. Une croissance régénérative peut être mesurée par rapport à ce plan, et en comparaison à l'controlatéral barbeau. Tissus Barbel régénère rapidement, atteignant la repousse maximale dans les 2 semaines de blessure.

Techniques d'analyse de la régénération barbeau comprennent la dissection et l'inclusion des paires de barbillons (se régénérer et de contrôle) dans les puits d'un gel d'électrophorèse d'ADN standard. Spécimens embarqués sont commodément photographié sous un stéréomicroscope pour la morphologie et la morphométrie brute, et peut être stocké pendant des semaines avant d'applications en aval tels que l'histologie de paraffine, cryosectioning, et / ou immunohistochimie monter ensemble. Ces méthodes d'établir le barbeau maxillaires comme un roman dans le système de tissus in vivo pour l'étude de la capacité régénératrice de multiples types de cellules dans le contexte génétique de poisson zèbre.

Protocole

Le poisson zèbre élevage

Le poisson zèbre sont logés et élevés selon des méthodes standard ^1. Passé la période de fin larvaire, le stade de développement d'un poisson zèbre peut être mesurée par sa longueur standard (SL), ou la distance en ligne droite en millimètres du point plus antérieurs de la lèvre supérieure à la base de la nageoire caudale (la plaque posteriormost hypural) ^2. A environ un mois après la fécondation (10-12 mm LS), les barbillons nasaux et maxillaires apparaissent comme transparents bourgeons épithéliaux près du puits olfactives et sur les coins postérieurs des maxillaires, respectivement. Comme le poisson zèbre mûrit, les barbillons s'étendent dans étroite, moustache appendices semblables. Parce que le barbillon maxillaire est plus large (2-3 mm) et plus facile à manipuler, notre protocole ne s'applique qu'aux cet appendice particulier; des techniques similaires, cependant, pourrait être adapté aux plus petits le barbeau nasale.

Clipping Barbel

1. Anesthésier poisson zèbre adulte au stade désiré (p. ex., De 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 mois après la fécondation) par immersion dans de 0,015% MS-222 (éthyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate) tamponné à pH 7,0 dans de l'eau du système. Observez les mouvements de natation jusqu'à arrêter et ventilation des branchies devient lente et régulière. Selon la taille du poisson, une anesthésie complète prend environ 2-5 minutes.
2. Utiliser une résille d'aquarium, le transfert de poissons 1-3 à la fois à un morceau plié de serviette en papier humide dans une boîte de Pétri. En utilisant une spatule, d'orienter le poisson donc ils sont parallèles les uns aux autre côté et latéral gauche en place. Pliez une partie de la serviette en papier humide sur la partie caudale du poisson, couvrant tout le corps jusqu'à l'opercule (opercules) pour garder la peau et les branchies humides pendant la procédure.
3. Voir la plaque de Petri sous la loupe binoculaire, en utilisant la lumière incidente à angle faible pour éclairer la région de la tête. Focus sur la base de la gauche barbeau maxillaire, qui fait saillie de l'angle ventral postérieur du maxillaire (Fig. 1).
   
   Figure 1.
4. Étroitement saisir l'arbre de l'légèrement distale au bord du maxillaire barbeau. Élevez l'arbre barbeau et insérez les mâchoires d'une paire de ciseaux à ressort à pointe fine juste en amont de la pince. Les ciseaux peuvent être touchés à la pince pour la stabilité. Glissez les mâchoires de la paire de ciseaux le long de la tige du barbeau jusqu'à la pointe se rapproche du bord du maxillaire. Fermer les ciseaux pour couper à travers l'arbre barbeau. Le barbeau amputée, toujours serrée dans la pince, peut être enlevé pour la fixation ou observation.
5. Immédiatement transférer le poisson à un petit réservoir d'eau potable du système (~ 500 ml) contenant une goutte de bleu de méthylène pour le contrôle superficiels infection fongique. Laisser le poisson à récupérer pendant la nuit. Le lendemain matin, retour le poisson pour le système d'élevage. Barbel régénération est maximale après 2 semaines.

Incorporation de gélose de paires appariées Barbel

1. Recueillir les poissons par la technique d'euthanasie appropriées et fixer dans un tube de 50 ml de 4% de paraformaldéhyde-tampon phosphate salin (PBS) avec agitation à 4 ° C pendant la nuit. Le volume fixateur doit être d'au moins dix fois le volume du tissu. Après fixation, d'éliminer les déchets paraformaldéhyde dans un contenant approuvé et rincer le tissu à fond dans plusieurs changements de PBS.
2. Préparer dans un flacon en verre de 250 ml 150 ml d'agarose à 2% (T _m ~ 37 ° C) dans de l'eau distillée. Chauffer avec un micro-ondes ou plaque chauffante, en agitant périodiquement jusqu'à dissolution complète. Equilibrer la solution fondue dans un bain de 50-60 ° C eau.
3. Assemblez un gréement gel standard d'électrophorèse en plaçant un moule gel de petits joints (10 x 10 cm; ~ volume de 100 ml de gel) fermement contre les parois de la chambre tampon. Ajouter 2-4 petit échantillon en dents de peigne (4 x 1,5 mm).
4. Sur une surface plane, verser la fondue d'agarose dans le moule pour juste couvrir la base des peignes, formant des puits très peu profond. Immédiatement mis l'agarose restes de nouveau dans le bain d'eau chaude, ce qui sera utilisé plus tard pour intégrer le tissu (étapes 9-12). Mettez une longue pipette Pasteur en verre dans le ballon pour maintenir la pipette à la même température que l'agarose.
5. Laisser le gel de durcir pendant 20-30 minutes. Retirer les peignes, puis retirez le moule du gel contenant le gel durci de la chambre tampon. Fermement bandes sur les côtés ouverts du moule avec du ruban de gel en laboratoire alors le gel ne glisse pas. Cette bande doit s'étendre de quelques millimètres sur la surface de l'agarose afin d'agarose supplémentaires peuvent être ajoutés plus tard (étape 13).
6. Position le moule du gel sur la scène d'un stéréomicroscope. Magnify un puits vide et rapprocher les bords au point.
7. Sur la surface de l'adjacentes au puits d'agarose, une pipette une goutte d'eau ou de tampon contenant les échantillons fixés barbeau (par exemple, se régénérer et de contrôle). Using plié broches insectes, faites glisser les échantillons humides dans le puits et les pousser vers le bas. Orienter le barbeau arbres parallèles les uns aux autres et alignés contre les bords opposés long du bien. La tension de surface va contribuer à maintenir le tissu en position.
8. Lorsque vous êtes prêt à intégrer, utiliser une pipette fine ou au coin d'un tissu de laboratoire pour enlever l'excès de fluides dans le puits. Travaillez rapidement afin de ne pas laisser les tissus se dessèchent.
9. Utilisation de la pipette Pasteur en verre réchauffé doucement pipette propre agarose fondu dans et autour des spécimens pour sceller le tissu barbeaux en place. Ne remplissez pas trop. Avant l'agarose durcit, faire ajustements de dernière minute avec les broches d'insectes.
10. Placez une étiquette en papier numéroté spécimen à côté du puits et le fixer avec une petite goutte d'agarose.
11. Répétez les étapes 6 à 10 pour chacun des puits d'échantillons.
12. Si vous le souhaitez pour le calibrage d'image, insérez un morceau de papier avec une échelle micrométrique imprimés (par exemple, http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) dans le fond d'un puits vide. Aplatir le papier au fond du puits et recouvrez chaude d'agarose.
13. Après tous les spécimens sont intégrés, la surface du gel sera irrégulière, avec des gouttes durcies d'agarose. Placer le gel sur une surface plane et verser doucement supplémentaires fondue agarose jusqu'à la surface supérieure est uniforme. Utilisez la plus petite quantité d'agarose nécessaire pour obtenir une surface lisse, trop d'agarose sera obscure diascopie photographie. Permettre que cette couche supérieure de durcir.
14. Le gel peut désormais être photographiés sur la scène d'un stéréomicroscope pour enregistrer la morphologie brute pour chaque paire de barbeau. Calibration des images est obtenue en photographiant l'échelle micrométrique embarqués.
15. Le gel complet peut être stocké enveloppé dans des serviettes en papier humide et scellé dans un sac en plastique à 4 ° pendant plusieurs semaines.
16. Pour une analyse plus poussée, des blocs de gélose contenant paire de barbillons peuvent être découpées dans du gel avec une lame de scalpel ou un rasoir et traitées pour l'histologie de paraffine ou cryosectioning par des méthodes standard ^3,4. Alternativement, barbeaux individuel peut être disséquée de l'agarose avec de fines aiguilles, rincés à l'eau, et traitées à d'autres applications en aval (par exemple, l'ensemble de montage immunohistochimie ou la microscopie confocale).

Discussion

Le poisson zèbre barbillon maxillaire est un système de tissu sous-utilisés pour l'étude de la croissance, l'entretien et la régénération de plusieurs types cellulaires chez le poisson zèbre. Bien que l'appendice n'a pas le barbeau analogue humain, les types de cellules qu'il contient sont hautement conservées, ce qui rend possible d'étudier la peau, les glandes, les mélanocytes vaisseaux circulatoires, et les nerfs dans une structure optiquement clair et anatomiquement cylindrique simple. Semblable à la nageoire caudale bien étudiés, le barbeau tissus peut être induite par l'amputation de se régénérer. Utilisation de la frontière du maxillaire comme un repère anatomique, le plan de l'amputation peut être placé précisément, à faciliter la mesure des barbeaux repousse. Pour un opérateur expérimenté, chaque opération ne prend que quelques secondes. La récupération est rapide, et nous avons jusqu'ici détecté aucun effet à court ou à long terme sur le comportement des poissons. Le poisson zèbre avec un barbeau nager maxillaires, manger et se reproduisent aussi efficacement que non-chirurgical des contrôles, et ont de survie comparable à l'époque de la collecte de tissus, jusqu'à 6 mois après la chirurgie. L'impact physiologique de cette chirurgie prédit d'être minime, car 1) les papilles extra réalisé sur le barbeau se retrouvent également sur ​​de nombreuses autres parties de l'épithélium de poissons, y compris les lèvres, les joues et la tête ^5, et 2) les papilles de différenciation apparaissent sur le barbeau régénération dans les 72 heures (Leclair et al., données non publiées). Cela rend le barbillon maxillaire un système minimalement invasives pour étudier la cicatrisation des plaies, la revascularisation et une réinnervation dans le cadre d'un vertébré adulte.

Après l'induction chirurgicale de la régénération, barbillons peuvent être prélevés à intervalles de mesure morphométrique et / ou l'analyse microscopique des tissus fixés. Idéalement, le barbillon maxillaire est d'environ la longueur (2-3 mm) et diamètre (100-200 mm) d'un embryon de poisson zèbre, de faciliter l'application de plusieurs protocoles standard, y compris histologie paraffine, cryosectioning, toute monture immunohistochimie, et in situ hybridation. Pris ensemble, ces caractéristiques font du barbillon maxillaire hautement réalisable modèle in vivo pour l'étude de la réparation des tissus et la régénération.

Matériaux

Matériel Microscope

Un microscope stéréoscopique à disséquer à transmettre et l'incident éclairage par fibre optique est nécessaire pour écrêtage barbeau et intégrant agar.

Clipping Barbel

• Poissons d'eau du système
• 2 réservoirs de poissons zèbres traversant
• MS-222 (éthyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate; Sigma Chemical # E10521-10G)
• stériles de 120 mm boîte de Pétri
• serviettes en papier humide
• spatule en métal émoussée
• Dumont # 55 Bio Inox forceps (Outils Fine Science # 11255-20)
• Des ciseaux à ressort Mini-Vannas (Outils Fine Science # 15000-00)
• agent bleu de méthylène antifongique (Drs Foster & Smith # CD-905781)
• petits aquariums résille

Collection de tissus et d'incorporation d'agar

• 4% en paraformaldéhyde 1x tampon phosphate salin (PBS-PF), jusqu'à aliquotés dans 50 ml tubes coniques et conservés congelés à -20 ° C
• 1x tampon phosphate salin (pH de 7,27 à 6)
• 250 ml flacon en verre
• Agarose à 2% dans de l'eau distillée
• standard de petites agarose rig électrophorèse sur gel (taille de gel = ~ 10 cm carrés)
• petites dents peigne échantillon d'électrophorèse (taille peigne 4 x 1,5 mm)
• bain d'eau tiède (50-60 ° C)
• bandes de laboratoire
• noir émaillé broches d'insectes, de taille 000 (Fine Science Tools # 26000-25)
• 1-2 détenteurs broches (outils Fine Science # 26016-12)
• 9-inch pipette Pasteur en verre
• poire ou la pompe
• tissulaire en laboratoire
• étiquettes en papier petits
• (Optionnel) échelle d'étalonnage imprimée
• serviettes en papier humide
• sac plastique zip de fermeture
• bistouri / lame de rasoir (pour découper des blocs de gélose)