Dans cette vidéo, article, nous présentons une méthode pour l'isolement et la purification de Drosophile Neurones périphériques en utilisant une bille magnétique rapide stratégie assisté tri cellulaire. ARN obtenu à partir des cellules isolées peuvent être facilement utilisés pour des applications en aval y compris les analyses de biopuces.
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Article de méthode
Isolement et purification de Drosophile Neurones périphériques en triant bille magnétique
Dans cet article
Résumé
Protocole
Commentaires généraux sur le tri des billes magnétiques neurones périphériques drosophile (Timing Total pour l'achèvement du Protocole: 2.5-3 heures)
Procédures de laboratoire standard pour maintenir un environnement propre, RNAse environnement libre doivent être respectées en tout temps pour prévenir la dégradation de l'ARN.
Lorsque la cuticule des larves de drosophile est disséqué et placé dans le buffer dissociation cellulaire, les neurones périphériques sont l'une des dernières cellules de se détacher de la cuticule. Nous avons exploité cette propriété et conçu ce protocole po....
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Discussion
Le protocole présenté ici est optimisé pour l'isolement et la purification des neurones périphériques qui adhèrent fermement à la surface interne de la cuticule drosophile troisième stade larvaire en utilisant une stratégie de billes magnétiques tri cellulaire. Alors que nous avons utilisé ce protocole pour isoler spécifiquement drosophile neurones DA, les applications de ce protocole à l'isolement des autres types de cellules qui adhèrent à la cuticule larvaire ou pupal de développement (par exemple l'épith.......
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Remerciements
Nous remercions les Drs. Yuh-Nung Jan et Wes Grueber pour fournir des stocks volantes utilisées dans cette étude. Les auteurs remercient F. Thomas et Kate Miller Jeffress Memorial Trust pour le soutien de cette recherche (DNC) et le Bureau du l'Université George Mason Provost (EPRI).
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Matériaux
Équipement
- (10) aimants néodyme de bloc (Magnetics J & K, Inc, Cat. # B444B), alternativement dynamag ™ -2 (Invitrogen, Cat. # 123-21D) peut être utilisé.
- Grinder Kontes tissu de verre, 2 ml de capacité de travail, avec un pilon grand dégagement (Cat. # 885300-0002)
- Filtres cellulaire, par exemple MACS Pré-Séparation Filtre (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407)
- Pétri de 35 mm-plats revêtus d'Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358-1004)
- Des outils de dissection: deux paires de pinces à Dumont n ° 5 (Outils Fine Science, n ° de cat 11251-20.)
- Vannas printemps micro-dissection ciseaux (Outils Fine Science, Cat. # 15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) avec embouts jetables
- Hémocytomètre standard pour compter les cellules et la pureté devis
- Pipettes Pasteur avec des conseils polies au feu de diamètre standard, réduit à ~ 50% du diamètre standard et réduit à ~ 25% du diamètre standard pour la trituration
- Table top micro-centrifugeuse (1-16,000 (x) g)
- Vortex
- Fluorescent stéréomicroscope (une MZ16FA Leica a été utilisé dans ce protocole)
Références
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling o....
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Réimpressions et autorisations
