Microinjection d'ADN dans intranucléaires Dissocié neurones de mammifères adultes

Résumé

Injection directe intranucléaire d'ADNc est une technique de transfection efficaces pour les cellules post-mitotiques. Cette méthode fournit des niveaux élevés d'expression de protéines hétérologues dans un ou plusieurs des constructions d'ADNc et la fonction des protéines permet d'être étudiée dans un environnement physiologiquement pertinents avec une variété de dosages seule cellule.

Résumé

Cultures primaires de cellules neuronales sont des outils précieux pour étudier la fonction des protéines, car ils représentent un système plus biologiquement pertinente par rapport aux lignées cellulaires immortalisées. Cependant, la nature post-mitotique de neurones primaires empêche efficacement l'expression des protéines hétérologues en utilisant des procédures communes telles que l'électroporation ou chimiquement transfection médiée. Ainsi, d'autres techniques doivent être utilisées afin d'exprimer efficacement des protéines dans ces cellules ne se divisent pas.

Dans cet article, nous décrivons les étapes requises pour effectuer des injections intranucléaire de constructions ADNc dans dissocié adulte neurones sympathiques. Cette technique, qui a été appliqué à différents types de neurones, peuvent réussir à induire l'expression de protéines hétérologues. Le matériel indispensable pour la procédure de micro-injection comprend un microscope inversé de visualiser les cellules, une pipette d'injection en verre rempli d'une solution d'ADNc qui est connecté à un N _{2 (g) le} système de livraison de pression, et d'un micromanipulateur. Le micromanipulateur coordonne le mouvement injection d'une pipette de microinjection avec une brève impulsion de pression de N ₂ pour éjecter solution d'ADNc de la pointe de la pipette.

Cette technique n'a pas la toxicité associée à de nombreuses méthodes de transfection et permet d'autres constructions d'ADN multiples d'être exprimée à un taux uniforme. Le faible nombre de cellules injectées rend la procédure microinjection bien adapté pour les études de la cellule unique, comme les enregistrements électrophysiologiques et d'imagerie optique, mais peut-être pas idéal pour les dosages biochimiques qui exigent un plus grand nombre de cellules et des efficacités de transfection supérieur. Bien microinjections intranucléaires nécessitera un investissement de l'équipement et le temps, la capacité à atteindre des niveaux élevés d'expression de protéines hétérologues dans un environnement physiologiquement pertinents rend cette technique un outil très utile pour étudier la fonction des protéines.

Protocole

I. Préparation pour l'injection

Cette section décrit les étapes de préparation qui doivent être prises avant l'injection d'ADNc dans le noyau des neurones. La procédure d'isolement pour les neurones est au-delà de la portée de cet article, mais il est important d'avoir les neurones dissociés en cellules individuelles et adhère bien à la surface inférieure de 35 mm plats de culture de cellules (voir discussion pour des conseils utiles pour atteindre cet objectif). Bien qu'une variété de différents neurones pourrait potentiellement être utilisé, les ganglions périphériques tels que les ganglions cervicaux supérieurs (GCS) ou les ganglions rachidiens sont préférés pour la dissection, car ils sont facilement accessibles et le rendement d'un grand nombre de neurones. Autres avantages de l'utilisation de neurones SCG sont qu'ils sont une population relativement homogène de cellules et bien caractérisés ^1,2,3,4.

A. Préparation du plasmide d'ADNc pour l'injection

1. Pour éviter la contamination ou de panne de l'ADN, les gants doivent être portés lors de la préparation.
2. ADN codant pour la protéine d'intérêt est sous-cloné dans un vecteur d'expression mammifère approprié, tel que pCI (Promega, Madison, WI), sous le contrôle du cytomégalovirus (CMV) fortement et constitutivement active. Si la protéine n'est pas étiqueté, un plasmide rapporteur, EGFP encodage par exemple (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), est co-injecté pour confirmer l'injection de succès et d'expression. L'ADN est isolé en utilisant une colonne de grande qualité de séparation (par exemple QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA) et purifiée en utilisant une unité centrifuge filtre avec un filtre en PVDF (0,1 um, Millipore, Bedford, MA) pour éliminer les particules dans le préparation de plasmide, qui peut obstruer pipettes d'injection au cours du processus d'injection. Les plasmides sont conservés à -20 ° C à une concentration d'environ 1 ug / ul dans un tampon de stockage d'ADN appropriés (par exemple tampon TE: Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0).
3. Immédiatement avant la microinjection, ADNc plasmidique sont dilués et mélangés à la concentration finale désirée dans un tampon TE ou H ₂ O. Typiquement, 5-10 ng / ul du gène rapporteur est suffisante pour marquer les cellules injectées, et la concentration totale de l'ADNc à injecter ne doit pas dépasser 200 ng / ul car l'ADN est visqueux à des concentrations élevées et peuvent obstruer les pipettes d'injection. Un petit volume d'ADNc pour injection (ul 5-10) est préparé par des gouttes de mélange de solution sur la surface propre d'un petit morceau de Parafilm (côté sous le support papier). Mélanger les gouttes d'une solution ensemble par pipetage de haut en bas plusieurs fois avec un pipetor et éviter d'introduire des bulles d'air lors du mélange.
4. En utilisant une pipette microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), transférer la solution d'ADNc dans un tube à hématocrite spécialement préparé (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Voir la section des matériaux pour des instructions sur la préparation des tubes à hématocrite (Tableau Matériaux). Placer le tube à hématocrite contenant la solution d'injection d'ADNc dans un tube de 1,5 ml.
5. Centrifuger le tube pendant 15-30 min à 10 000 g dans une microcentrifugeuse équipée d'un rotor à godets à angle fixe ou pivotant (Eppendorf), à température ambiante (20-24 ° C) aux particules de sédiments dans la solution d'ADNc qui peut bloquer le microinjection pipette. La solution d'injection d'ADNc peut être conservé à température ambiante pendant la séance d'injection.

B. La fabrication des pipettes d'injection

1. Pipettes en verre jetable microinjection sont disponibles commercialement (par exemple Femtotips, Eppendorf), qui sont pratiques mais coûteux (10 $ par microinjection pipette). Pipettes d'injection peuvent être fabriqués en laboratoire en utilisant un P-97 programmable extracteur Flaming pipette Brown (Sutter Instrument Company, Novato, CA) et filamenté, à parois minces tubes de verre borosilicate capillaire (instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride). Cette option est plus rentable et permet de contrôler la forme et la taille de la pipette de micro-injection.
2. Un programme en deux étapes est utilisée pour tirer étroite embouts de pipettes microinjection. Depuis l'ouverture de pipettes microinjection est trop étroit pour examiner sous un microscope optique, la qualité des pipettes d'injection doivent être évalués directement par l'injection de quelques cellules avant que les paramètres du programme sont finalisés. Les paramètres suivants sont approximatifs pour les réglages de la chaleur, tirer, la vitesse et le temps: (pull 1) 600, 115, 15, 250; (pull 2) 640, 130, 65, 200. Ces paramètres varient en fonction de différents lots de verre et par l'état du filament de chauffage dans l'extracteur, et doit être ajustée au besoin. Pour plus de détails, voir ^5.
3. Tirez plusieurs pipettes d'injection (2-5) par plat de neurones à injecter, en cas de dommages ou de problèmes lors de la séance d'injection. Pipettes d'injection Conserver dans un récipient couvert pour empêcher la poussière de pénétrer dans l'embout de la pipette de micro-injection.

II. Microinjection intranucléaire

tente »> Cette section détaille le processus de l'injection d'ADNc dans le noyau des neurones. Une microinjection de configuration de base comprend un contraste de phase inversée microscope (Nikon par exemple Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) de visualiser le processus, micromanipulateur (par exemple Eppendorf 5171) pour contrôler le mouvement de la pipette d'injection et une pression (par exemple Eppendorf FemtoJet Express) injecteur d'expulser la solution d'ADNc de la pipette. Raccordement de l'injecteur de pression pour le micromanipulateur permet la synchronisation de ces deux derniers processus au cours des injections. Autres facultative, mais fortement recommandée, les composants comprennent un système de surveillance vidéo montée (caméra CCD, Cohu Inc, San Diego, CA; noir et blanc du moniteur vidéo, Sony Corporation, Tokyo, Japon). Ce système n'est pas une exigence absolue pour les injections; Cependant, le moniteur noir et blanc offre un contraste élevé pour une meilleure visualisation du noyau cellulaire et offre une expérience de visualisation plus confortable pendant les séances d'injection de long. De plus, un ordinateur portable exécutant un logiciel d'exploitation d'un contrôleur à main peut être utilisée à semi- automatiser le processus d'injection (voir discussion pour plus de détails).

Le moment idéal pour injecter de neurones CTB est de 3-6 heures après la dissociation. A ce stade, les cellules sont sphériques, bien attaché au fond du plat, et le noyau est nettement visible, sous un microscope à contraste de phase, comme un organite central rond avec une membrane noire, contenant un seul ou plusieurs nucléoles (figure 1A).

1. Placez un plat de neurones dissociés sur le centre de la platine du microscope. Réglez la mise au point et optimiser l'optique à contraste de phase du microscope de sorte que le noyau des neurones sont clairement visibles.
2. Pipeter 2 ul de solution d'ADNc préparé dans une pipette de microinjection utilisant une pipette microloader. Évitez élaboration solution proche de la partie inférieure du tube hématocrite, car cela pourrait réveiller les particules qui se sont installés pendant la centrifugation. Le filament de la microinjection pipettes devrait aider à l'élaboration solution à la pointe, mais si petites bulles d'air persistent, tapotez doucement le côté du verre pour les déloger.
3. Insérez la pipette de micro-injection dans le support de l'injecteur capillaire pression, puis fixer le support à l'micromanipulateur. Le support est fixé à un angle de 45 °.
4. Abaissez la pipette de micro-injection dans le plat. Comme la pipette entre le milieu de culture, un ménisque se forme qui affecte la réfraction de la lumière et réduit la qualité d'image des neurones. Pour pallier ce problème, la tourelle anneau de phase peut être légèrement décalée jusqu'à ce que le noyau des neurones sont clairement visibles à nouveau.
5. Certains systèmes ont une pression d'injection "propre" fonction qui applique une pression maximale de l'air de la pipette de micro-injection pour une courte durée. Utilisez cette fonction pour effacer la pipette de débris avant de commencer et pendant les injections si la pointe apparaît bouché. Si du liquide dissipé n'est pas visible sur l'écran tout en utilisant cette fonction, le remplacer par une pipette d'injection neuf.
6. Centre de la pipette de micro-injection dans le moniteur de visualisation et d'aligner la pointe à côté d'un neurone et dans le même plan focal que le nucléole. Réglez cette position inférieure de l'axe z limite sur le micromanipulateur. Cette position est la profondeur de la pipette de micro-injection se qualifieront pour les injections au cours. Maintenant la position de la pointe d'environ 30 um dessus de ce point afin de la pipette de microinjection efface le haut de neurones.
7. Le "injecter" une mode de Eppendorf 5171 micromanipulateur peut être définie avec les paramètres suivants pour effectuer des injections intranucléaires. La fonction d'injecter est activée, tandis que la fonction empaler est laissé. Un chemin d'injection diagonale (le long du x et l'axe z) produit le moins de dommages aux cellules, et donc le mode axial doit être utilisé pour les injections. Une vitesse d'injection de 300 um / s est suffisant, et de synchroniser la montée en pression lorsque la pipette de micro-injection atteint l'ensemble axe z limite.
8. L'injecteur de pression contrôle la quantité de solution d'ADNc injecté dans le noyau. Dans le mode d'injection «automatique», la livraison de l'ADN est contrôlée dans le temps et initiée par le micromanipulateur connecté. La pression d'injection (Pi) devrait être fixé entre 100 et 200 hectopascals (hPa; 1 hPa ~ 0.015 psi); des pressions d'injection plus élevée n'améliore pas le taux de réussite ou la qualité des injections et peut indiquer d'autres problèmes avec la taille de la pointe de micro-injection pipette ou de l'ADN pureté . Une durée d'injection (ti) de 0,3 s et une pression de compensation (Pc) de 30 hPa, ce qui fournit une pression positive constante pour éviter l'entrée de l'occlusion des particules du milieu de culture dans l'embout de la pipette, devrait être utilisé.
9. Position du neurone à être injecté sous la pointe de la pipette de micro-injection en utilisant le contrôle du microscope XY de l'axe. Aligner l'extrémité de la pipette au-dessus du centre du noyau en se concentrant avant et en arrière entre tIl pointe et les nucléoles.
10. Injecter le noyau en appuyant sur le bouton d'injecter (sur le micromanipulateur). Pour l'étape d'injection, le mouvement de la pipette de micro-injection et le déversement d'une solution d'ADNc sont contrôlés par le micromanipulateur. Il est difficile de confirmer succès injections intranucléaires à l'œil nu, mais l'injection de la solution de viscosité relativement faible d'ADNc (par rapport à l'environnement visqueux nucléaire), apparaît souvent comme un panache blanc à contraste de phase optique et peut être utilisé comme un indicateur de l'injection dans le noyau. Parfois, la pipette de micro-injection ne pénètre pas la membrane nucléaire et pousse simplement le noyau. Une tentative de deuxième injection à la même position peut conduire à une injection réussie d'ADN dans le noyau. Gonflement de la cellule est généralement un indice de l'injection cytoplasmique involontaire. En outre, gonflement significatif nucléaire n'est pas bien toléré par les neurones et entraîne généralement la mort cellulaire peu après, ainsi, la pression d'injection et la durée ne doit pas dépasser les valeurs suggérées.
11. Continuer injectant des neurones en repositionnant la platine du microscope pour aligner le neurone suivant sous la pipette de micro-injection. Systématiquement naviguer dans le plat à injecter approximativement 50-100 noyaux avant de retourner le plat de neurones dans l'incubateur pour une nuit d'incubation. Réussir neurones injectés peuvent être identifiés le jour suivant par l'expression du gène rapporteur.

III. Les résultats représentatifs

Figure 1: cervical supérieur ganglionnaires (CTB) neurones.
L'image en contraste de phase de la SCG neurones 3 heures après la dissociation (A). A ce stade, le noyau est nettement visible qui aide l'alignement de la pointe de pipette de microinjection. Le noyau apparaît au centre de neurones avec un seul (à gauche) ou plusieurs (à droite) nucléoles sombre.
CTB neurones 16 heures suivant l'injection d'ADNc EGFP dans le noyau (B). Gauche, CTB neurones vue sous un éclairage en contraste de phase. A droite, l'image de l'épifluorescence mêmes neurones montrant l'injection réussie et résultant en une expression de l'EGFP neurone.
Barre d'échelle blanc est de 20 um.

Figure 2: cellules entières enregistrements des courants qui traversent hétérologue-exprimé couplés aux protéines G intérieurement rectifier K ⁺ (GIRK) chaînes de neurones SCG.
GIRK courants (I _GIRK) ont été évoqués par une rampe de tension 200 ms de -140 à 40 mV à partir d'un potentiel de maintien de -60 mV (en médaillon de A) après l'activation du endogènes α _{2-adrénergiques} par la norépinéphrine (NE, 10 uM) . Des traces superposées sont des enregistrements du même neurone et indiquer avant (noir) et après l'application des deux seuls NE (bleu) ou NE plus 10 mm Ba ^{2 +} (rouge). Les lignes pointillées indiquent le niveau zéro de courant.
Pour l'enregistrement, je _GIRK, la solution externe contenue (en mm) 130 NaCl, 5,4 KCl, HEPES 10, 10 CaCl _2, MgCl ₂ 0,8, 15 de glucose, le saccharose 15, et 0,0003 TTX, ajusté à pH 7,4 avec NaOH. La solution d'enregistrement interne contenue (en mm) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl _2, MgCl 2 _2, 10 HEPES, 4 MgATP, et 0,3 Na ₂ GTP, ajusté à pH 7,2 avec KOH.
Le manque de courant provoquée par la rampe de tension en présence du NE dans les neurones SCG non-injecté (A) montre que les neurones SCG n'expriment pas les chaînes GIRK endogène. D'injection réussie d'ADNc codant pour une fonctionnelle plasmide GIRK canal ¹¹ donne lieu à des courants importants pendant la rampe de tension lorsqu'ils sont exposés à NE (B, gauche). Les courants ont les caractéristiques typiques des courants à travers les canaux GIRK: activation par un agoniste des récepteurs aux protéines G couplées (NE), rectification entrante, et de bloquer des courants par le bloqueur des canaux GIRK putatif, Ba ^{2 +} (B, oligo-rouge de droite). Les cercles vides et remplis représentent j'ai _GIRK dans l'exploitation et courant crête, respectivement. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 2.

Discussion

Les problèmes communs rencontrés et suggestions:

Comme mentionné précédemment, le succès des injections nucléaires dépendent de la présence des cellules adhérentes à des plaques de culture de tissus. Retarder le début des injections de quelques heures suivant la procédure dissociation cellulaire permet aux neurones de se conformer au fond des plats. En outre, les plats revêtement avec 0,1 mg / ml de poids moléculaire élevé de poly-L-lysine (Sigma, St. Louis, MO) l'adhérence de neurones aides à la surface inférieure de plats.

Le blocage des pipettes microinjection, surtout lorsque l'on tente d'injecter une forte concentration de l'ADN, peut être un problème fréquent. L'utilisation de haute qualité de colonnes de séparation pour isoler et purifier l'ADN plasmidique, et d'effectuer les étapes de purification supplémentaires mentionnés (filtres spin, tourner dans des tubes à hématocrite) peut aider à éliminer les particules avant l'injection. Pendant les injections, le «propre» en fonction de la pression de l'injecteur peut être utilisé (pour 0,2 s est suffisant), mais si cela ne résout pas le problème, une pipette nouvelle injection doit être utilisée. Si la majorité des pipettes microinjection s'obstruer lors d'une séance d'injection, envisager de modifier les paramètres de l'extracteur pipette de verre pour produire embouts de pipettes microinjection avec une plus grande ouverture.

Une autre question qui se pose lors des injections nucléaire est l'irrégularité de la surface de fond de boîtes de culture tissulaire. Cette variabilité influe directement sur la précision du ciblage des embouts de pipettes d'injection dans le noyau depuis la profondeur de la pipette traverse lors des injections est fixé. Par conséquent, cette limite axe z doivent être ajustés au cours des injections dans le même plat. Il sera évident lorsqu'un ajustement est nécessaire: il n'y aura pas d'indication de l'injection nucléaire (pas de panache blanc dans le noyau ou la cellule est entièrement manqué), ou l'embout de la pipette d'injection est proche du fond du plat (en comprimant la cellule ou même s'écraser la pointe de pipette dans le fond du plat). Verre-clonage cylindres (. OD 10 mm, no 2090-01010, Bellco Glass, Vineland, NJ) peut être utilisé pendant le placage de neurones à les restreindre dans un petit espace plus confiné, donc en minimisant la distance nécessaire pour déplacer la pipette d'injection entre les injections. Ces cylindres de clonage sont retirés avant de procéder à des microinjections.

Inconvénients de la technique:

Microinjections intranucléaires sont techniquement exigeantes, qui exigent de la patience et un haut degré de dextérité manuelle par l'opérateur. Maîtrise avec cette technique, comme avec n'importe quelle autre compétence, vient avec la pratique. Ainsi, il est conseillé de pratiquer des injections nucléaires du gène rapporteur seuls avant de tenter des expériences réelles. Afin d'aider davantage le processus d'injection, il peut être possible de consolider les étapes du micromanipulateur et la pression d'injection dans un programme informatique. Des programmes tels que Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) peut être utilisée pour stocker les paramètres de la micro-injection et de programmer les contrôleurs multifonctions (ShuttlePro, Contour Design, Windham, NH) de semi-automatiser le processus d'injection (voir 6,7,8 pour les plus de détails).
Un autre inconvénient de la technique de micro-injection intranucléaire est le faible taux de réussite. Environ 10-20% des tentatives d'injections nucléaires conduisent à l'expression des protéines. Alors que cette efficacité peut être suffisant pour les applications qui ne nécessitent pas un grand nombre de cellules exprimant, électrophysiologie, par exemple, pour les différents dosages biochimiques cela peut ne pas être suffisant.

Applications de la technique:

Malgré ses inconvénients, la microinjection intranucléaire de l'ADN est une technique extrêmement utile pour hétérologue exprimant des protéines dans les neurones.

Des niveaux élevés d'expression de protéines sont obtenus avec microinjections nucléaire en raison du grand nombre de plasmides libérée dans le noyau lors des injections, un promoteur très actif CMV régulation de la transcription des gènes, et la stabilité à long de plasmides dans le noyau. Protéines sur-expression est particulièrement utile dans dominante négative des expériences où des niveaux élevés de protéines hétérologues sont requis pour submerger la protéine endogène. Un autre avantage de intranucléaires injections est la capacité à fournir une proportion constante de constructions d'ADNc dans le noyau lors des constructions multiples sont injectés. Avec d'autres méthodes de transfection, il est difficile d'introduire de façon reproductible la même proportion de chaque construction d'ADN dans les cellules différentes dans le même plat et entre les transfections. L'injection directe de la solution d'ADNc dans le noyau élimine cette source de variabilité et permet au ratio de protéines exprimées à être titré de manière efficace.

Méthodes de transfection traditionnelles ont une efficacité limitée dans les cellules post-mitotiques raison de l'incorporation à faible de l'ADN dans le noyau ⁹ et toxicité des produits chimiques associés à REAG transfectionents ^10. Microinjections nucléaire surmonter ces problèmes en introduisant du matériel génétique mécaniquement dans le noyau. Bien que cette technique est plus complexe, la possibilité d'étudier l'effet d'une protéine dans un système biologique fonctionnel, complet avec les voies de signalisation endogènes, fait plus que compenser le caractère laborieux de cette technique.

Toutes les procédures expérimentales sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les National Institutes of Health Guide de protection des animaux et d'utilisation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Unité de filtration Ultrafree-MC	EMD Millipore	UFC30VV00	Filtre Durapore PVDF ; taille de pore de 0,1 μm
tampon TE	Quality Biological, Inc.	351-010-131	10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0
Tubes capillaires de micro-hématocrite	Fisher Scientific	22-362-574	Préparation non héparinisée : Imbiber dans de l'éthanol à 100 % pendant toute une nuit. Laver soigneusement trois fois avec de l'eau déionisée et sécher par cuisson du verre dans un four (95°C). Couper les tubes d'hématocrite nettoyés en morceaux de 3-4 cm à l'aide d'un stylet à pointe de diamant, et sceller une extrémité à l'aide d'une flamme et de pinces pour maintenir le verre. Conserver dans un bécher en verre propre et couvrir pour éviter l'accumulation de poussière.
Microcentrifugeuse	Eppendorf	5417 R	Avec rotor à angle fixe ou à godets oscillants
Embouts de pipette Microloader 20 μl	Eppendorf	5242 956.003
Verre capillaire pour microinjection	World Precision Instruments, Inc.	TW120F-4	Paroi fine avec filament, diamètre extérieur de 1,2 mm, diamètre intérieur de 0,9 mm, longueur de 100 mm
Tireuse de micropipettes Flaming/Brown	Sutter Instrument Co.	P-97	Avec filament en platine-iridium (référence FB330B)
Microscope inversé Nikon Diaphot TMD	Nikon Instruments		Objectifs à contraste de phase 20x et 40x, montés sur une table d'isolation vibratoire
Caméra à couplage de charge (CCD)	Cohu Inc.	6410
Moniteur vidéo	Sony Corporation	PVM-122	Noir et blanc, écran de 9”
Système de micromanipulateur	Eppendorf	5171
Unité de microinjection	Eppendorf	FemtoJet Express
Contrôleur de microinjection	Contour Design	S-PROV2	Contrôleur multimédia programmable
Igor Pro	WaveMetrics	Version 4.05A	Programme de commande permettant de contrôler le contrôleur de microinjection, écrit par S. Ikeda