Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

Résumé

Ce protocole décrit la dérivation de cellules souches hématopoïétiques transplantables à partir des cellules souches embryonnaires de souris (CES) et leur injection ultérieure dans des souris irradiées de façon létale bénéficiaires. Brièvement, l'ESC sont différenciées comme des corps embryoïdes, qui sont ensuite infectées par HOXB4 rétroviraux et co-cultivées avec des cellules stromales et OP9 cytokines hématopoïétiques.

Résumé

Une cellule souche est définie comme une cellule avec la capacité à la fois à l'auto-renouvellement et de générer de multiples descendance différenciée. Les cellules souches embryonnaires (CSE) sont dérivées de la blastocyste de l'embryon précoce et sont pluripotentes dans la capacité de différenciation. Leur potentiel de différenciation majorité en a fait l'objet de nombreuses recherches centrées sur la façon de les déduire coaxial pour générer des types cellulaires cliniquement utiles. La dérivation réussie de cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la souris ESC a récemment été accompli et peuvent être visualisées dans ce protocole vidéo. HSC, sans doute la population cellulaire la plus cliniquement exploitées, sont utilisés pour traiter une multitude de cancers hématopoïétiques et troubles. Toutefois, de nombreux patients qui pourraient bénéficier d'un traitement HSC n'ont pas accès aux bailleurs de fonds appropriés. ESC pourrait fournir une source alternative de HSC pour ces patients. Le protocole suivant établit une base à partir desquelles l'ESC-HSC peuvent être étudiés et les efforts visant à isoler les CSH de CSE humaines. Dans ce protocole, l'ESC sont différenciées comme des corps embryoïdes (EBS) pour 6 jours dans le sérum disponible dans le commerce présélectionnés pour la différenciation hématopoïétique optimale. EB sont alors dissociées et infectés par HOXB4 rétroviraux. Infected EB cellules dérivées sont étalées sur OP9 stroma de la moelle osseuse de cellules stromales dérivées de la ligne de la calvaria de M-CSF / - souris, et co-cultivées en présence de l'hématopoïèse promotion des cytokines pendant dix jours. Lors de cette co-culture, les cellules infectées connaissent une forte expansion, ce qui entraîne la génération d'une piscine hétérogène de 100s de millions de cellules. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées à des souris de sauvetage et de reconstituer une irradiation létale.

Protocole

Différenciation des cellules souches embryonnaires

1. Recueillir un flacon à proximité de confluence des cellules souches embryonnaires (CSE), via un traitement avec la trypsine ESC.
2. Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu de différenciation et de transférer à un T25 sans gélatine couché. Incuber à 37 ° C pendant 45 minutes. Récupérer le surnageant et recueillir les cellules par centrifugation.
   
   Note: les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) de l'ESC cultures attachent facilement à la T25 sans gélatine couché et ne sont donc appauvri de la culture au cours de cette étape de placage. Si vous n'êtes pas la culture de ....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris déficientes C57Bl/6 Rag-2/gamma-c	Animal	Taconic Farm
Agitateur de plaque	Outil	VWR international	33998-360	Agitateur orbital par Ikaworks
Pipetteur multicanal	Outil	VWR international	15000-174	ePet par BioHit
Trypsine ES	Réactif	Invitrogen	15090-046	Trypsine à 0,25 % dans le PBS
Trypsine standard	Réactif	Invitrogen	25300-062	Trypsine-EDTA à 0,05 %
PBS	Tampon	Invitrogen	20012-027
Tampon de dissociation sans enzyme	Tampon	Invitrogen	13151-014
Mélange d'enzymes de dissociation	Tampon	Invitrogen	17104-019	500 mg de collagénase IV
Hyaluronidase	Réactif	Sigma-Aldrich	H2126	congeler en aliquots de 500 μL et éviter les cycles répétés de congélation-décongélation.
DNase	Réactif	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Sulfate de protamine	Réactif	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
Milieu de différenciation EB	Milieu			Veuillez consulter la recette dans le fichier Protocol.doc joint
IMDM à 10 %	Milieu			Veuillez consulter la recette dans le fichier Protocol.doc joint
IMDM à 10 % + cytokines	Milieu			Veuillez consulter la recette dans le fichier Protocol.doc joint
anti-MEM à 20 %				Veuillez consulter la recette dans le fichier Protocol.doc joint